簡介：第二十五章免疫學(xué)診斷,教學(xué)要求1掌握凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的定義及其基本類型。2掌握間接免疫熒光法和ELISA的雙抗夾心法及間接法的基本操作步驟。3熟悉檢測體液免疫和細胞免疫的常用試驗方法。4了解免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用。,第二十四章免疫學(xué)診斷,免疫學(xué)診斷即用免疫學(xué)方法確定疾病相關(guān)因子、監(jiān)測疾病過程、判斷療效及預(yù)后，涉及對疾病相關(guān)因子的診斷和輔助診斷，以及檢測機體免疫功能狀態(tài)。第一節(jié)抗原或抗體的檢測抗原抗體反應(yīng)原理抗原的抗原決定基與抗體的結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)應(yīng)具有互補性，二者相互結(jié)合后，在適宜條件下，可出現(xiàn)可見反應(yīng)。,免疫學(xué)診斷,一、抗原抗體反應(yīng)的特點（一）抗原抗體反應(yīng)的特異性指一種抗原只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的專一性。它是免疫學(xué)診斷的重要基礎(chǔ)。1親和力AFFINITY抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合強度。2親合力AVIDITY一個抗體分子與整個抗原之間的結(jié)合強度。3抗血清4一抗5二抗,免疫學(xué)診斷,（二）抗原抗體反應(yīng)的可見性抗原、抗體比例適合時，在適宜的鹽濃度下可形成肉眼可見的反應(yīng)物（凝集物或沉淀物）。（三）抗原抗體反應(yīng)的可逆性抗原抗體之間的結(jié)合主要是分子表面的非共價鍵結(jié)合，穩(wěn)定，但在適當條件（如低PH、高濃度鹽、凍融等）下可解離開，各自的生物學(xué)特性不發(fā)生改變。根據(jù)此特點，可利用親合層析法純化抗原或抗體。,,（五）影響抗原抗體反應(yīng)的因素P3791溫度適當?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子碰撞的機會，加快二者結(jié)合速度。不宜過高過低。2電解質(zhì)可使IC復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)。常用生理鹽水稀釋抗原或抗體。,免疫學(xué)診斷,3酸堿度最適PH6～8，否則可出現(xiàn)假陰或假陽性結(jié)果4抗原和抗體性質(zhì)抗體的特異性和親和力是關(guān)鍵，初次應(yīng)答抗體親和力低，單克隆抗體親和力低；抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡等。,二抗原或抗體的檢測方法,根據(jù)抗原的性質(zhì)、出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分不同，可將抗原抗體反應(yīng)分為下列幾類（一）凝集反應(yīng)（AGGLUTINATIONP381細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在適宜電解質(zhì)下形成肉眼可見凝集物的反應(yīng)。,,1直接凝集玻片和試管凝集2間接凝集正相間接凝集和反向間接凝集。補充介紹3協(xié)同凝集以SPA為載體的反向間接凝集。在微生物檢測中常用。4間接凝集抑制試驗,,,抗原或抗體的檢測方法,（二）沉淀反應(yīng)（PRECIPITATIONP380血清蛋白質(zhì)、細菌裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的反應(yīng)。1單向免疫擴散SINGLEIMMUNODIFFUSION（1）特點定性定量試驗（2）用途可用于測定血清IGG,IGM,IGA和C3等的含量（3）原理沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)。（4）操作鋪板打孔加樣放濕盒看結(jié)果。,,,,,,,,,,,,,,,2雙向免疫擴散DOUBLEIMMUNODIFFUSION（1）特點定性半定量（2）用途用于抗原或抗體的定性檢測、組成和多抗原相關(guān)性分析。（3）操作鋪板打孔加樣放濕盒看結(jié)果。,,,,,,3對流免疫電泳試驗（補充介紹）其實質(zhì)是將雙擴與電泳相結(jié)合。（1）特點定性試驗（2）用途主要用于病原微生物抗原的定性檢測。（3）操作鋪板打孔加樣電泳看結(jié)果。,,,,,,,,4免疫電泳（IMMUNOELECTROPHORESIS也是將電泳技術(shù)與雙向免疫擴散結(jié)合的一種技術(shù)，先電泳后雙向免疫擴散（見圖）。,,5免疫比濁（IMMUNOEPHELOMETRY）在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間形成IC，液體渾濁，用濁度計測反應(yīng)體系的濁度，據(jù)標準曲線推算樣品中抗原含量。,,（四）免疫標記技術(shù)P381用熒光素、酶、放射性核素等標記抗原或抗體后進行抗原抗體反應(yīng)。提高檢測靈敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫熒光標記技術(shù),1免疫熒光法可對標本中的抗原進行鑒定和定位。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE），前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。用途可用于檢查細菌、病毒、螺旋體等的抗原或抗體，幫助診斷傳染??；也可用于鑒定免疫細胞的CD分子，檢測AID的抗核抗體等。,,（1）直接法缺點是每檢查一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。（2）間接法敏感性比直接法高，制備一種熒光二抗可用于多種抗原的檢查，但非特異性增多。,,,,,,2酶免疫測定是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合。敏感度可達1UG/L,甚至1NG/L。常用的標記物有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）等。常用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY,ELISA）測定可溶性抗原或抗體，用酶免疫組化法測定,免疫酶標記技術(shù),組織中或細胞表面的抗原。（1）ELISA①雙抗體夾心法用于檢測可溶性的特異性抗原。操作基本步驟用已知抗體包板洗滌封板洗滌加入待檢標本洗滌加酶標抗體洗滌加底物顯色結(jié)果觀察。,,,,,,,,,,免疫酶標記技術(shù),②間接法檢測特異性抗體。非特異性增加。基本步驟用已知抗原包板加入待檢標本加酶標二抗加底物顯色觀察結(jié)果。,,,,,,,免疫標記技術(shù),（2）酶免疫組化法將酶標抗體與組織或細胞表面的抗原反應(yīng)后，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查，對抗原進行定性、定量、定位檢測。3放射免疫測定法用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學(xué)檢測，敏感度可達PG水平。常用于檢測微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、嗎啡、地高辛藥物和IGE等。,,4免疫印跡法P383又稱WESTERNBLOTTING，用于蛋白質(zhì)檢測。是將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體后，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。?？蓹z測多種病毒的抗原或抗體。,第二節(jié)淋巴細胞的測定,淋巴細胞是機體內(nèi)主要的免疫細胞，檢測其數(shù)量和功能是了解機體免疫狀態(tài)的重要手段。一淋巴細胞的分離常用FICOLL（淋巴細胞分離液）密度梯度離心除去紅細胞、粒細胞而獲得外周血單個核細胞（PBMC），再經(jīng)吸附除去單核細胞而得到淋巴細胞。若要分離T細胞，可用尼龍毛柱、抗CD3單抗、E花結(jié)試驗等分離。,,,二、淋巴細胞的鑒定P386根據(jù)淋巴細胞的某些標志，采用免疫熒光法、磁珠分離法、流式細胞術(shù)等方法可確定細胞的不同類型和比例。（一）T細胞功能測定1T細胞增殖試驗植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（CONA）等絲裂原及抗CD3單抗等能非特異性激活培養(yǎng)的T細胞，使其轉(zhuǎn)化成淋巴母細胞的試驗。,淋巴細胞功能測定,在該增殖過程中，細胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，細胞形態(tài)改變。也可檢測特異性抗原致敏的T細胞。（1）氚標記的胸腺嘧啶核苷摻入法該法靈敏、可靠，應(yīng)用廣泛，但需特殊儀器（液體閃爍儀），易有放射性污染。（2）MTT法該法操作簡單，無放射性污染，但敏感性相對較差。,淋巴細胞功能測定,2細胞毒試驗TC、NK細胞對靶細胞有直接殺傷作用，可根據(jù)待檢效應(yīng)細胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)的靶細胞。（1）51CR釋放法用51CR標記靶細胞，Γ記數(shù)儀測定釋放的51C活性。（2）MTT法其原理與增殖試驗相同，但甲生成量與靶細胞溶解破壞水平呈負相關(guān)。,,3細胞因子檢測CK的檢測有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細胞，監(jiān)測某些疾病狀態(tài)的細胞免疫功能。常用的檢測方法有以下三種（1）ELISA法（2）生物活性測定法（3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,淋巴細胞功能測定,4皮膚實驗正常機體對某種抗原產(chǎn)生細胞免疫后，用相同抗原做皮膚試驗時出現(xiàn)以局部紅腫為特征的DTH。細胞免疫正常時出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細胞免疫低下則呈陰性反應(yīng)。該方法簡便，可幫助診斷某些病原微生物感染（如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌等）及免疫缺陷病等。,淋巴細胞功能測定,（二）B細胞功能測定P389B細胞介導(dǎo)體液免疫，檢查B細胞的數(shù)量與功能是確定體液免疫是否正常的重要手段。1B細胞增殖試驗2抗體形成細胞的測定吸附有特異性抗原的SRBC與抗體形成細胞分泌的IG特異性結(jié)合后活化補體，溶解SRBC。又稱溶血空斑試驗。,,第四節(jié)免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用（自學(xué)）,
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簡介：西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞株CNE凋亡實驗研究,麻發(fā)強黃勇攀貴陽醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院貴陽醫(yī)學(xué)院,西妥昔單抗CETUXIMAB是一種特異性針對EGFR的單克隆抗體，與EGFR結(jié)合可阻斷其自身受體相關(guān)激酶的活化與磷酸化以及有絲分裂信號的下傳，抑制腫瘤細胞的增殖、生長和誘導(dǎo)凋亡。,前言,2006年美國FDA批準C225作為二線方案治療失敗的晚期頭頸部鱗癌。但對鼻咽癌治療中的作用還需要進一步的探討。本實驗主要研究西妥昔單抗聯(lián)合熱療與放療誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞株凋亡的效果和可能的機制。,前言,一、材料與方法,細胞培養(yǎng)人鼻咽癌細胞株CNE購于中國科學(xué)院上海細胞庫，培養(yǎng)于含10胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)48H，37℃恒溫，5％CO2,95％濕度環(huán)境中傳代培養(yǎng)。,試驗分組細胞胞培養(yǎng)48H后隨機組；先加入工作濃度（10ΜG/ML）的西妥昔單抗05ΜL，48H后照射，放療12GY照射劑量。再行43℃熱療30MIN，后37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時和48小時。,實驗分組,HOCHEST33258熒光染色法觀察細胞凋亡,將干凈無菌的蓋玻片置于30MM2培養(yǎng)皿，接種細胞過夜；當50～80滿時，同前述處理；24H后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗兩遍；固定液固定后用HOCHEST332585MG/L染色；雙蒸水沖洗，封片；熒光顯微鏡下觀察并隨機拍照。,流式細胞術(shù)檢測各組CNE的凋亡率,取對數(shù)生長期的CNE細胞，每25CM2的培養(yǎng)瓶接種2106個細胞，每組設(shè)3個平行樣本，分別經(jīng)規(guī)定的處理因素處理后，消化收集細胞，用BINDING緩沖液400ΜL重懸，調(diào)整細胞密度為1106/ML；加入5ΜLANNEXINVFITC，混勻，4℃避光孵育15MIN；加入10ΜLPI染液（20ΜG/ML），4℃避光孵育5MIN后上流式細胞儀檢測，繼續(xù)培養(yǎng)24H和48H后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。,WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達,加含PMSF裂解液冰上裂解30MIN提取蛋白，4℃12000RPM離心5MIN，取上清，蛋白定量后調(diào)整至濃度相同，95℃變性5MIN，8聚丙烯胺凝膠電泳2H，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5脫脂奶粉封閉1H。一抗（分別為1200稀釋的BAX、BCL2、ΒACTIN抗體4℃過夜，TBST洗膜3次（每次5MIN）。,WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達,二抗1500稀釋羊抗鼠IGGAP室溫孵育1H，TBST洗膜3次（每次5MIN），AP顯色，運用圖像分析儀對結(jié)果進行圖像分析，計算條帶的積分吸光度，以ACTIN水平作為等量蛋白上樣參照。BAX和BCL2蛋白的測定，每組重復(fù)四次，以均值代表測定結(jié)果。,統(tǒng)計學(xué)方法,實驗結(jié)果用SPSS160統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果以均值±標準差MEAN±SD表示，兩組間比較采用配對資料T檢驗；多組間比較采用單因素方差分析STUDENTNEWMANKEULS檢驗。P005表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。,,二、結(jié)果,結(jié)果,1、熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變（400）,A對照組B單純放療組,B,C放療熱療組,D放療西妥昔單抗,E放療熱療西妥昔單抗,2、ANNEXINV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果,聯(lián)合應(yīng)用ANNEXINVFITC和PI對培養(yǎng)體系中的細胞進行染色，ANNEXINV/PI代表健康活細胞，ANNEXINV/PI代表早期凋亡細胞，ANNEXINV/PI代表晚期凋亡和壞死細胞。本實驗經(jīng)處理后，主要觀察ANNEXINV/PI的早期凋亡細胞。,2、ANNEXINV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果,A對照組B單純放療組C放療熱療組,D放療西妥昔單抗組E放療熱療西妥昔單抗組,2、ANNEXINV/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果,表示與對照組比較，P＜005；※表示與單放組、放熱組、放西組比較，P＜001；＊表示與24H比較，P＜005,表1西妥昔單抗聯(lián)合放療與熱療誘導(dǎo)CNE細胞凋亡效果分析,3、WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達,為了檢測不同處理因素作用CNE后24H的BAX、BCL2蛋白表達情況與單放組、放療熱療組比較，放療西妥昔單抗和放熱西妥昔單抗聯(lián)合治療組BAX蛋白表達有差異（P＜005）；與單放、放療熱療放療西妥昔單抗比較，放熱西妥昔單抗聯(lián)合治療組下調(diào)BCL2蛋白表達作用顯著（P＜005）（圖3）,3、WESTERNBLOT分析BAX、BCL2蛋白的表達,,?ACTION（42KD）,BAX20KD,BCL2（26KD）,3、WESTERNBLOT分析BAX蛋白的表達,,,表示放療西妥昔與單放組和放熱組比較，P＜005；表示綜合治療組與單放組、放熱組、放西組比較，P＜005，,3、WESTERNBLOT分析BCL2蛋白的表達,,表示綜合治療組與單放組、放熱組、放西組比較，P＜005，,,三、討論,討論,腫瘤的分子靶向治療是當今腫瘤研究中的熱點，其中EGFR在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在高表達和異常激活1。西妥昔單抗作為一種人鼠嵌合型抗體。與EGFR結(jié)合可抑制由內(nèi)源性配體引起的EGFR活化，細胞周期中G1停止，細胞增殖減少，凋亡增加，血管生成減少，侵襲力、轉(zhuǎn)移能力降低。,討論,CURRAND等報道單用西妥昔單抗與放療聯(lián)合都取得了理想的抗腫瘤效果6，F(xiàn)ENGFY等報道證實單用西妥昔單抗與放療聯(lián)合對頭頸部腫瘤細胞有放療增敏作用7。,討論,熱療是公認的“綠色治療”，幾乎無副作用，是臨床上重要的輔助治療方法之一。近年來，通過與化放療聯(lián)合，熱療作為一種輔助的抗腫瘤手段日益受到人們重視。,討論,西妥昔單抗誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、擾亂腫瘤細胞增殖動力學(xué)，使細胞周期停滯在對放療相對敏感的G1期，而使對放療抗拒的S期細胞減少，從而增加細胞的放療敏感性9。熱療誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡10，可抑制放療引起的亞致死損傷及潛在致死損傷的修復(fù)11；熱放療協(xié)同。,討論,本實驗序顯示放療、放熱、放西妥昔單抗或放熱西妥昔單抗治療后可出現(xiàn)CNE細胞形態(tài)學(xué)改變，引起凋亡，尤其靶放熱三者聯(lián)合形態(tài)學(xué)改變最為顯著；流式細胞凋亡檢測顯示聯(lián)合治療組的凋亡率均顯著高于單放、放熱、靶放組，表明三者在誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡的過程中有較好的協(xié)同作用。,討論,在細胞凋亡調(diào)控過程中，采用分子生物學(xué)手段檢測了促凋亡蛋白BAX和抑凋亡蛋白BCL2的表達。結(jié)果顯示各干預(yù)組BCL2蛋白表達均有不同程度的下降，這就說明放療、放療熱療、靶療放療及靶放熱療治療能夠抑制，但以靶放熱降低最為明顯。,討論,BAX促凋亡蛋白，在各干預(yù)組中，靶療放療及靶放熱中表達最為明顯，這說明靶療放療熱有協(xié)同促進了腫瘤細胞的凋亡。,結(jié)論,西妥昔單抗聯(lián)合放療及熱療在體外試驗顯著增加鼻咽癌細胞株CNE的凋亡率，其機制可能與調(diào)控BAX、BCL2蛋白的表達促進凋亡有關(guān)。,謝謝,
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