簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學中國醫(yī)學科學院博士學位論文尖銳濕疣病變的人乳頭瘤病毒分子流行病學研究及L1序列多態(tài)性分析和在原核表達體系中的表達姓名洪少林申請學位級別博士專業(yè)皮膚性病學指導教師王家璧曾毅200211中國協(xié)和醫(yī)科大學博士論文PAGEPBSPCRPVRFLPSDSTAETBS．TTETEⅧDTNFVLPX。堅ALPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS聚丙烯酰胺凝膠電泳PHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液POLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈式反應PALIILLOMAVIRUS乳頭瘤病毒RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM限制性片段長度多態(tài)性SODIUMDODECYLSULFATE十二烷基磺酸鈉TRISACETICEDTABUFFERTAE緩沖液TRISBUFFEREDSALINE．TWEEN吐溫TRIS鹽緩沖液TRISEDTABUFFERTE緩沖液N，N，N’，NTETRAMETHYLETHLENEDIAMINE四甲基乙二胺TUMORNECROSISFACTOR腫瘤壞死因子VINLSLIKEPARTICLE病毒樣顆粒5BROMO一4一CHLORA一3一INDOLYLBDGALACTOSIDE5一溴4M氯一3一嗚哚一BD半乳糖苷北京協(xié)和醫(yī)院2

簡介：點擊查看更多人巨細胞病毒感染IgM抗體捕獲ELISA方法的建立和應用.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的利用同尾酶構建基因同向串聯(lián)體的方法，構建ALLOFERONL基因2串聯(lián)體重組質(zhì)粒，并將其在大腸桿菌中融合表達。為大規(guī)模制備ALLOFERONL奠定基礎。方法根據(jù)瑞士微生物肽數(shù)據(jù)庫APD收錄的ALLOFERONL氨基酸序列，選擇大腸桿菌偏愛密碼子設計并合成該基因序列。利用同尾酶法構建同向串聯(lián)體的要求，在目的基因的5’端引入ECI酶切后的粘性末端，并在其后引入XBAI的酶切位點；在目的基因的3’端引入SALI酶切后的粘性末端，并在其前引入NHEI的酶切位點，同時在XBAI位點后和NHEI位點前引入蛋氨酸MET密碼子ATG，構成溴化氰CNBR裂解位點。將合成的ALLOFERONL基因克隆到載體PUC18上，轉化大腸桿菌DH5Α，即可獲得ALLOFERONL單拷貝工程菌。利用XBAIT▽CTAGA與NHEIG▽CTAGC互為同尾酶的特性，二酶切割后的粘性末端均為CTAG，可以進行連接，但連接后的新序列TCTAGC不被二酶再識別，采用SCAIPUC18上位于多克隆酶切位點外的一個酶切位點XBAI和SCAINHEI分別雙酶切單拷貝重組質(zhì)粒，回收大片段PUC18ALLOFERONL和小片段ALLOFERONL，進行連接，轉化DH5A，用ECI和SALI雙酶切重組質(zhì)粒即可得到ALLOFERONL2拷貝串聯(lián)體。將其與PGEX4T1表達載體連接，轉化大腸桿菌BL21，即可獲得ALLOFERONL2拷貝串聯(lián)體工程菌。對IPTG誘導時機、IPTG誘導溫度和IPTG誘導時間等條件進行摸索，最終確定了最佳表達條件當菌液A600NM≈08時加入終濃度為05MMOLLIPTG誘導表達4H后，經(jīng)SDSPAGE電泳觀察融合蛋白得到了可溶性的高效表達。用GSTRAPFF1ML預裝柱手工進行GST融合蛋白的純化，經(jīng)SDSPAGE電泳觀察得到了ALLOFERONL2拷貝融合蛋白31KD。結果1、按照設計的方案進行操作，獲得了ALLOFERONL基因2串聯(lián)體，經(jīng)ECI和SALI雙酶切PGEX4T1ALLOFERONL2重組質(zhì)粒之后，在約110BP處可見一條清晰的DNA條帶，其大小與理論計算值相符。2、重組的PGEX4T1ALLOFERONL2質(zhì)粒DNA經(jīng)雙脫氧末端終止法測序，結果證明，本研究構建的ALLOFERONL基因2串聯(lián)體的核苷酸序列和閱讀框完全正確。3、含重組PGEX4T1ALLOFERONL2的菌液經(jīng)終濃度為05MMOLL的IPTG誘導表達后，經(jīng)SDSPAGE分析，在37℃誘導表達4H后，在細菌裂解上清中出現(xiàn)了一條MR約為31103的新生GST融合蛋白帶，其分子質(zhì)量大小與理論計算值相符。結論本研究成功構建了ALLOFERONL基因2串聯(lián)體重組質(zhì)粒，獲得了可成功表達相應目標融合蛋白的2拷貝串聯(lián)體工程菌。對其表達條件進行了優(yōu)化，獲得了具有較高純度的ALLOFERONL2拷貝融合蛋白31KD，為進一步純化得到ALLOFERONL單體及其抗病毒活性測定奠定了基礎。

簡介：【目的】在獻血者常規(guī)篩查工作的基礎上，對獻血者進行人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型或Ⅱ型HTLVⅠⅡ抗體檢測，同時追蹤調(diào)查受血者輸血前后HTLV感染情況，以了解廣州地區(qū)獻血人群HTLVⅠⅡ感染情況和輸血傳播HTLV的風險度，對用蛋白印跡法WB檢測陽性者用PCR法進行擴增，以測定HTLV基因序列，比較廣州地區(qū)HTLV的基因序列與其他代表株的同源性，為探討HTLV與安全輸血的關系和是否對獻血者進行HTLVⅠⅡ檢測作為常規(guī)檢測項目提供重要的參考數(shù)據(jù)，為預防輸血傳播疾病提供重要依據(jù)?！痉椒ā?采取ELISA法檢測廣州血液中心9000例無償獻血者HTLVⅠⅡ抗體。2對200名受血者進行HTLVⅠⅡ抗體檢測，再平均分成兩組，第一組輸注已經(jīng)HTLVII抗體篩查的血液，第二組輸注未經(jīng)HTLVⅠⅡ抗體篩查的血液，1個月后采取ELISA法檢測兩組受血者輸血后HTLVⅠⅡ抗體。3HTLVⅠⅡ抗體ELISA法檢測陽性者用原試劑進行雙孔復試，雙孔復試陽性者用蛋白印跡法WB進行確證。4WB確證陽性者重新采集樣本5ML，EDTA抗凝，加入FICOLLHYPAQUE溶液分離淋巴細胞。5分離后的淋巴細胞采用TAKARA公司的DNA抽取試劑盒抽取HTLVⅠ前病毒DNA。6設計合成兩對引物ENV區(qū)和LTR區(qū)。7對2例陽性標本進行PCR擴增。8應用測序儀對PCR陽性產(chǎn)物進行DNA測序?！窘Y果】19000例無償獻血者標本有10例HTLVⅠⅡ抗體ELISA初篩呈陽性反應，再用原試劑進行雙孔復試只有2例陽性，陽性率為002％29000。2200名受血者輸血前后HTLVⅠⅡ抗體均為陰性。3這2例陽性標本用WB進行確證，兩者均為HTLVⅠ型血清反應陽性。42例陽性標本PCR檢測均在720BPENV區(qū)和501BPLTR區(qū)處出現(xiàn)反應帶。5測序結果兩例陽性標本與HTLVⅠ型WHP代表株同源性分別為標本1ENV區(qū)993％LTR區(qū)990％。標本2ENV區(qū)994％LTR區(qū)992％?！窘Y論】1廣州地區(qū)獻血人群HTLV感染率尚處于一個較低的水平。2200名受血者未出現(xiàn)因輸血而感染HTLV的情況，說明廣州地區(qū)通過輸血傳播HTLV的風險還處于較低的水平。3廣州地區(qū)獻血人群2例陽性者均為HTLVⅠ型，廣州地區(qū)HTLV流行情況以HTLVⅠ型為主，未發(fā)現(xiàn)HTLVⅡ型。4兩例陽性者與HTLVⅠ型WHP代表株同源性均達99％或以上。

簡介：登革熱是通過伊蚊傳播的一種急性傳染性疾病。按血清型別分類，DENV有四個血清型，分別為DENV1、DENV2、DENV3及DENV4。登革熱在全球的主要流行區(qū)域為熱帶、亞熱帶地區(qū)。全世界范圍內(nèi)，有一百多個國家出現(xiàn)過登革熱流行，約有25億人的健康受到登革熱威脅，每年新發(fā)感染病例上億人，當中需要住院治療的重癥患者約50萬，約有25萬死亡病例。而我國，登革熱主要流行于南方沿海地區(qū)，以廣東的登革熱疫情最為嚴峻。在廣東，近乎每年均有病例報道，而且四種登革病毒均有過流行，其中廣州是登革熱的高發(fā)病率城市。自1995年以來，DENV1為廣東登革熱主要流行毒株，但是2009年發(fā)生了DENV3流行，說明近年來流行于其他國家和地區(qū)特別是東南亞地區(qū)其他血清型別的登革病毒有向廣東省輸入的趨勢。由此，關注臨床登革熱病例特點、分離登革病毒株并分析其病原學特征，對于全面闡述廣東登革熱疫情的流行趨勢及特征、病原體的來源和登革熱防治等都具有重大意義。研究對象廣東省廣州市第八人民醫(yī)院2010年8～12月間收治的登革熱病例。研究目的對2010年8～12月流行的登革病毒株進行血清型別鑒定，對培養(yǎng)分離新獲得的登革病毒株全基因組序列，進行進化樹分析，了解2010年登革流行病例的病原體及其基因組特點，以明確廣州登革熱的分子流行病學特點。研究方法1收集47例登革熱患者的病例資料，檢測47例登革熱患者急性期和恢復期的血清登革IGM及IGG抗體。2提取早期血清中病毒RNA逆轉錄為CDNA，NESTPCR擴增CPRM區(qū)，PCR產(chǎn)物測序后進行DNA序列比對分析，確定登革病毒的血清型。3用C636細胞培養(yǎng)分離一名DENV4感染患者的急性早期血清中的登革病毒。4使用PCRDESIGN及DNACLUB軟件，設計擴增登革病毒全基因組序列的10對PCR引物，通過RTPCR擴增后進行基因序列測定，同時利用生物信息學相關知識對測序結果進行分析。研究結果147例登革熱病例中，輸入病例占128％，其余812的病例為本地流行病例，結合患者的臨床、實驗室資料，及登革病毒特異性抗體檢測結果（47例患者急性期IGM均為陽性、IGG陰性；恢復期IGM均為陰性、IGG陽性），均為登革熱確診病例。220例患者PCR陽性，經(jīng)電泳分析PCR產(chǎn)物后，14例出現(xiàn)大小為392BP的特異性片段，6例擴增出119BP大小的片段。經(jīng)測序鑒定PCR產(chǎn)物進一步證實分別為DENV4和DENV2感染，前者全是本地感染病例，后者有輸入病例（2例）及本地病例（4例，均發(fā)生在輸入病例之后）。3用C636細胞成功從其中1名DENV4患者急性期的早期血清中分離出登革病毒株，經(jīng)全基因組序列測定，廣州DENV4株全長10631BP，構建進化樹后分析證實此病毒株為登革4型病毒基因亞型Ⅱ毒株與印度尼西亞的病毒株同源性最高。4與目前我國最早于1978年分離出的登革4型病毒基因亞型Ⅱ毒株相比，廣州2010年登革4型病毒株發(fā)生了堿基變異586個，氨基酸變異100個。結論12010年8～12月廣州以DENV4流行為主，且是本地流行；同時有DENV2感染病例，輸入病例的發(fā)生先于本地病例。22010年流行于廣州的登革4型病毒經(jīng)進化樹分析與印度尼西亞毒株同源度最高，提示廣州的DENV4可能來源于印度尼西亞。與1978年的廣東毒株屬于同一個基因亞型但同源性不高。

簡介：黟四川大學臨床醫(yī)學博士專業(yè)學位論文知功能之間是否存在關聯(lián)，作者對86個抽動穢語綜合癥核心家系進行了研究。方法1采用聚合酶鏈擴增技術對86個漢族抽動穢語綜合癥核心家系多巴胺D4受體第3外顯子48BP重復多態(tài)性、多巴胺轉運蛋白1非編碼區(qū)40BP多態(tài)性、兒茶酚胺一氧位一甲基轉移酶MET／VAL基因多態(tài)性、白介素一L受體拮抗劑第2內(nèi)含子86BP重復多態(tài)性、白介素1D基因外顯子5多態(tài)性進行分析，了解等位基因從雜合子父母向子代傳遞和非傳遞的頻率，用遺傳傳遞不平衡檢驗分析上述基因多態(tài)性和抽動穢語綜合癥之間是否存在連鎖不平衡。2用STROOP測驗STROOPTEST、連線測驗TRAILMAKINGTEST、言語流暢VERBALFLUENCYTEST、威斯康辛卡片測驗MODIFIEDWISCONSINCARDSORTINGTEST等神經(jīng)心理學測量工具對抽動穢語綜合癥患者進行測試，并和51名健康兒童進行比較，了解抽動穢語綜合癥認知損害特點，對不同共病情況的認知功能也進行了分析，觀察上述多個功能基因多態(tài)性對抽動穢語綜合癥及其共病情況的影響。3用上述部分神經(jīng)心理學測驗工具對抽動穢語綜合癥患者父母認知功能狀況進行調(diào)查，對患者父母的認知功能特點進行初步研究。結果1多巴胺D4受體第3外顯子48BP重復多態(tài)性、多巴胺轉運蛋白1非編碼區(qū)40BP多態(tài)性、兒茶酚胺一氧位一甲基轉移酶MET／VAL基因多態(tài)性、白介素1受體拮抗劑第2內(nèi)含子86BP重復多態(tài)性、白介素1B基因外顯子5多態(tài)性和抽動穢語綜合癥之間來存在連鎖不平衡。2D4受體第3外顯子48BP重復多態(tài)性和注意缺陷多動綜合癥共病組存在連鎖不平衡，注意缺陷多動綜合癥共病組白介素L受體拮抗劑410BP／240BP雜合子基因型頻率和抽動穢語綜合癥非共病組比較有顯著性差異F7914，P0005，注意缺陷多動綜合癥共病組240BP等位基因頻率和抽動穢語綜合癥非共病組比較也有顯著性差異7341，P0007；

簡介：點擊查看更多異種移植相關的豬肉源性逆轉錄病毒的調(diào)查和實驗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的探討血清APELIN13的水平與乙肝病毒相關性慢性肝病的關系及其臨床意義。方法收集臨床12例健康對照者和78例乙型肝炎病毒相關性慢性肝病患者的血清，其中慢性乙型肝炎31例，肝硬化26例，原發(fā)性肝癌21例。采用酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測血清APELIN13的水平，臨床常規(guī)方法檢測丙氨酸氨基轉移酶ALT、天門冬氨酸氨基轉移酶AST、總膽紅素TBIL、膽堿酯酶CHE、白蛋白ALB、白蛋白與球蛋白的比值（AG比值）、谷氨酰轉肽酶GGT、凝血酶原時間PT、血小板計數(shù)PLT、乙肝病毒E抗原HBEAG、甲胎蛋白AFP、乙型肝炎病毒DNAHBVDNA等。分析血清APELIN13水平的差異及與相關臨床指標間的關系。結果1與正常組26036±1510NGML比較，慢性乙型肝炎組27742±1695NGML、肝硬化組80214±3430NGML、原發(fā)性肝癌組27545±1099NGML血清APELIN13水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。組與組之間的兩兩比較慢性乙型肝炎組與肝硬化組、原發(fā)性肝癌組與肝硬化組均存在統(tǒng)計學差異P＜001，慢性乙型肝炎組與原發(fā)性肝癌組差異無統(tǒng)計學意義P0997。2乙型肝炎相關慢性肝病患者不同病毒復制分組之間血清APELIN13的表達不存在統(tǒng)計學差異（P＞005）。3不同程度慢性乙型肝炎患者中，重度組血清APELIN13水平最高。且輕度組與重度組、中度組與重度組之間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P＜005）。輕度組與中度組之間差異無統(tǒng)計學意義（P0997）。慢性乙型肝炎組血清APELIN13水平與肝功能指標中ALT、AST、TBIL、CHE和PT水平均沒有相關性，與ALB水平、AG比值呈顯著負相關。與ALB（R0602，P0000），與AG比值（R0405，P0024。4肝硬化患者血清APELIN13水平與GGT和GGTPLT比值沒有相關性，與ASTALT比值、ASTPLT比值呈正相關。與ASTALT比值R0555，P0003），與ASTPLT比值R0467，P0016。且肝硬化組患者血清APELIN13水平隨CHILDPUGH分級級別增高而增高，C級與A級、C級與B級比較均有統(tǒng)計學差異口P＜001），A級與B級比較無統(tǒng)計學差異P0894。5原發(fā)性肝癌組血清APELIN13水平與AFP沒有相關關系R0047，P0863。結論1APELIN13參與乙型肝炎病毒相關性慢性肝病發(fā)展。2APELIN13在HBV復制中的作用尚不明確。3血清APELIN13水平可能是評估肝儲備功能的指標之一。通過監(jiān)測血清APELIN13水平變化可評估慢乙肝患者疾病的嚴重程度，對判斷其預后有一定價值。4血清APELIN13水平可反映肝硬化的病情嚴重程度。

簡介：廈門大學碩士學位論文音樂認知研究及其腦電的計算分析姓名劉海衛(wèi)申請學位級別碩士專業(yè)計算機軟件與理論指導教師周昌樂20080401ABSTRACTTHEENJOYINGANDCREATIONOFMUSICCOVERALMOSTALLTHECOGNITIONPROCESSOFHUMANBRAIN，INCLUDINGPERCEPTIONATTENTIONSTUDYMEMORYEMOTION，ANDSOONTHESTUDYOFMUSICCOGNITIONISTHEIDEALSTARTOFCOGNITIONRESEARCHANDITHASVERYIMPORTANTINFLUENCEONDISCOVERINGTHEMYSTERYOFBRAINNOWADAYS，THEREALEMOREANDMORERESEARCHESINTHISFILED，ANDITHASBECOMEAHOTPROBLEMTHATISBEINGDISCUSSEDINWORLDTHISPAPERFOCUSESONTHEEFFECTONTHECOGNITIONWHICHISBROUGHTBYCROSSCULTURALMUSICINTHISPAPERMUSICALEFFECTONHUMANATTENTIONANDNEURALMECHANISMAREDISCUSSEDTHOROUGHLYGENERALLYISSUESMENTIONEDINTHISPAPERAREASFOLLOWINTHEFIRSTPART，BOTHLONGTERMANDSHORTTERMEFFECTSOFGNQINANDPIANO’SMUSICONCHINESEWEREINVESTIGATEDTHROUGHFOURERPEXPERIMENTS，ITDISCUSSEDTHEDIFFERENTEFFECTSOFGUQINANDPIANOONAUDITORYANDVISUALATTENTIONRESPECTIVELYTHERESULTSSHOWEDTHATTHEREWEREVERYDIFFERENTEFFECTSOFGUQINANDPIANOONATTENTION，ACCORDINGTOWHICHTHISPAPERDREWANEWCONCLUSIONINTHESECONDPART，EEGDATAWASREVERTEDINTOPALLIUM’SFUNCTIONMODEBYUSINGICAANALYSISMETHODANDTHENCLUSTERINGANALYSISWASINTRODUCEDTOGETBRAINMOVEMENTIN鏟EDIENTRELATETOCOGNITIONASSIGNMENTINTHISWAYWECANANALYZEEEGDATAFURTHERANDTHENWECANUNDERSTANDTHEMODEOFBRAINWHENBRAINCOGNIZESNOTONLYISTHISPAPERACREATIVEWORK，BUTALSOHASGOTSOMENEWANDMEANINGFULRESULTSHOWEVERWEJUSTDIDSOMEPRIMARYRESEARCH，ANDNEEDMORESTUDYINTHEFUTUREIHOPEOURWORKISUSEFULFORTHISFIELDKEYWORDMUSICCOGNITION；ERP；ICAIII

簡介：背景和目的肝細胞材料已成為限制生物人工肝BIOARTIFICIALLIVERBAL及肝細胞移植HEPATOCYTESTRANSPLANTATIONHTX發(fā)展的瓶頸問題這一問題的解決必將大大提升BAL及HTX的臨床實用價值理論上講人肝細胞包括成人肝細胞及人胎肝細胞最為理想但成人供肝來源極其有限且僅用于肝移植加之成人肝細胞在體外增殖能力差故大量獲得成人肝細胞是不可能的胎肝的利用因涉及倫理問題亦難以推廣應用使用動物肝細胞又存在發(fā)生免疫反應及傳播動物病毒的危險肝細胞株如HEPG2、C3A、HHY41、HEPZ等分化功能較原代肝細胞差且多為瘤源性或由原代肝細胞經(jīng)病毒轉染獲得存在安全性問題可回復性永生化程序為解決細胞材料問題提供了新的思路及手段其基本原理是先將永生化基因猿猴病毒40大T抗原基因SIMIANVIRUS40LARGETANTIGENGENESV40T導入原代細胞以獲得永生化細胞株使其獲得體外增殖能力然后再以特異性位點重組技術切除SV40T基因使細胞株回復到永生化前的狀態(tài)這樣細胞既得到了增殖又不具有致癌性及病毒感染的可能性根據(jù)這一原理該實驗構建了含SV40T的逆轉錄病毒載體旨在為人肝細胞的可回復永生化奠定基礎該研究共分三部分進行第一部分為菌落聚合酶鏈反應POLYMERASECHAINREACTIONPCR篩選重組陽性克隆方法的建立旨在為構建載體的快速鑒定提供有效手段第二部分為SV40T外顯子的拼接和PLLTSN的構建旨在刪除其內(nèi)含子并縮短外源基因DNA的長度以利于后續(xù)基因的插入第三部分為可回復永生化逆轉錄病毒載體PLNCTIGLOX的構建旨在為肝細胞的可回復永生化奠定基礎方法1采用合成的LOXP正義單鏈為上游引物載體互補的序列為下游引物并直接以菌落為模板進行PCR對插入LOXP序列的重組陽性克隆進行鑒定并用酶切法鑒定LOXP序列重組陽性克隆兩者效果作對比分析2以質(zhì)粒PUC19SV40T為模板高保真PCR分別擴增SV40T的兩個外顯子3重疊延伸拼接法SPLICINGBYOVERLAPPINGEXTENTIONSOE連接SV40T的兩個外顯子刪除其內(nèi)含子序列4將SOE拼接的SV40T定向克隆于逆轉錄病毒載體PLXSN的ECⅠ和BAMHⅠ酶切位點之間構建逆轉錄病毒載體PLLTSN5用菌落PCR和酶切分析篩選鑒定PLLTSN重組陽性克隆并對PLLTSN載體上的21KBSV40T進行DNA測序分析和互聯(lián)網(wǎng)比對6以PLLTSN提供21KBSV40T插入PIRES2EGFP的ECⅠ和BAMHⅠ酶切位點之間構成的載體命名為PCTIG7用XHOⅠ和NOTⅠ從PCTIG上切下SV40TIRESEGFP片段連接到PLNCX2質(zhì)粒載體上相同的限制酶切位點構建逆轉錄病毒載體PLNCTIG8人工合成具有與XBAⅠ酶切末端相同4堿基粘端的LOXP互補雙鏈將其插入到PLNCTIG載體3LTR的U3區(qū)XBAⅠ位點結果1自身引物菌落PCR篩選出LOXP小片段重組陽性克隆而用酶切方法鑒定未能清楚顯示結果2成功拼接了SV40T兩個外顯子刪除其內(nèi)含子序列并獲得含21KBSV40T的逆轉錄病毒載體PLLTSNDNA測序分析和互聯(lián)網(wǎng)比對顯示所拼接21KBSV40T為無內(nèi)含子的VA45541株SV40T的編碼序列3通過菌落PCR和酶切分析篩選和鑒定獲得了新霉素耐藥基因NEOMYCINRESISTANCEGENENEO、SV40T和加強型綠色熒光蛋白ENHANCEDGREENFLUESCENTPROTEINEGFP共表達的真核表達載體PCTIG和永生化逆轉錄病毒載體PLNCTIG4單酶切位點連接法于PLNCTIG的3LTR插入LOXP重組識別位點獲得了可回復永生化逆轉錄病毒載體PLNCTIGLOX結論1該實驗建立了高效、快速、經(jīng)濟、簡便的自身引物菌落PCR方法將酶切分析法中小片段大小的判斷標準轉化為較大的PCR產(chǎn)物的有無使重組陽性克隆的鑒別變得更為容易成功地篩選出短片段LOXP序列重組陽性克隆2通過基因的重疊延伸拼接法SOE成功拼接了SV40T基因的2個外顯子獲得無內(nèi)含子的SV40T編碼序列DNA片段并克隆于逆轉錄病毒載體上同時構建了含SV40TIRESEGFP雙順反子的真核表達載體PCTIG和PLNCTIG3于逆轉錄病毒載體PLNCTIG的3LTR的U3區(qū)插入CRELOXP重組系統(tǒng)的特異性重組識別位點LOXP構建成可回復永生化逆轉錄病毒載體PLNCTIGLOX為后續(xù)的人肝細胞可回復永生化研究奠定了基礎

簡介：點擊查看更多RNA干擾抗乙型肝炎病毒的體外實驗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的乙型肝炎病毒HBV感染危害巨大，慢性乙肝至今仍缺乏有效的治療手段和解決方案，HBV感染機制的研究進展相對滯后是嚴重影響新型治療方法和藥物研發(fā)的重要原因之一。PRES1在HBV感染過程中具有很重要的作用，對于研究意義重大，但目前缺乏其特異性單克隆抗體，影響了其功能的深入研究。本研究通過原核表達純化PRES1蛋白，利用雜交瘤技術制備PRES1特異性單克隆抗體，為進一步研究奠定基礎。方法1采用PCR法擴增含HINDⅢ與XBAⅠ酶切位點的PRES1基因片段，原核表達載體PGSTMOLUC及PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，用TDNA連接酶將兩者連接并轉化到大腸桿菌JM109構建并篩選重組質(zhì)粒。隨后將重組質(zhì)粒轉入表達宿主菌BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導表達，對表達蛋白進行SDSPAGE電泳分析和WESTERNBLOT檢測。以谷胱甘肽SEPHAROSE4B凝膠為填料進一步采用親和層析純化融合蛋白。2用PRES1融合蛋白作為抗原免疫BALBC小鼠，采用雜交瘤技術，制備抗PRES1的單克隆抗體，用ELISA方法篩選分泌抗PRES1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，采用間接ELISA方法和WESTERNBLOT進行MCAB特異性鑒定；同時采用間接ELISA方法鑒定MCAB的IG亞類，檢測MCAB的效價及相對親和力，并進行MCAB結合表位分析。并對其染色體進行分析。結果1采用PCR方法擴增得到與預期大小一致的目的基因片段。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實重組質(zhì)?？寺〕晒?，命名為PGSTPRES1。轉化表達宿主菌后成功誘導出分子量為37KD的GSTPRES1融合蛋白，與預期分子量相符，誘導表達融合蛋白約占總菌蛋白的10％左右。WESTERNBLOT檢測表明誘導表達的融合蛋白能分別與抗GST的單抗和抗PRES1的單抗發(fā)生特異性結合。采用谷胱甘肽SEPHAROSE4B凝膠純化融合蛋白，純化蛋白純度約為90％左右。2成功篩選出兩株可分泌特異性MCAB的雜交瘤細胞P1A1和P283，其抗體亞類分別為IGG，IGG；將生長良好的雜交瘤細胞接種到預處理的BALBC小鼠腹腔中制備腹水型PRES1的單克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA證明腹水效價可達10；WESTERNBLOT結果鑒定提示該單克隆抗體可以特異的結合PRES1。ELISA相加實驗結果顯示2株MCAB識別不同的抗原表位。結論綜上所述，我們運用重組DNA技術與原核表達方法獲得了PRES1融合蛋白，利用該蛋白成功制備了PRES1單克隆抗體，所得抗體具有生物學活性，其抗體亞類分別為IGG和IGG。為我們進一步探討乙型肝炎病毒PRES1的生物學功能及其在HBV感染中的作用奠定了堅實的基礎。

簡介：慢性腎臟病CHRONICKIDNEYDISEASE，CKD是全球關注的公共衛(wèi)生問題之一，國內(nèi)外發(fā)病率逐年上升。約5％的CKD患者最終將發(fā)展成終末期腎功能衰竭，需終身接受腎臟替代治療。其中，腹膜透析PERITONEALDIALYSIS，PD是符合我國國情的主要腎臟替代治療方法，但長期PD可引起腹膜纖維化，導致超濾衰竭ULTRAFILTRATIONFAILURE，UFF，進而影響PD的長期應用，是患者退出PD的主要原因。轉化生長因子ΒTRANSFMINGGROWTHFACTΒ，TGFΒ是腹膜纖維化發(fā)病機制中的關鍵因素，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)腹膜間皮細胞上皮間充質(zhì)轉分化EPITHELIALMESENCHYMALTRANSITION，EMT在TGFΒ誘導的腹膜纖維化中起重要作用，是腹膜纖維化啟動和可逆的關鍵環(huán)節(jié)。結締組織生長因子CONNECTIVETISSUEGROWTHFACT，CTGF具有促進細胞增殖、遷移和分化等作用，研究證實CTGF通過介導TGFΒ1，或直接作用其下游信號分子，與許多組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關。已有研究發(fā)現(xiàn)，CTGF不僅在PD腹膜纖維化中起到關鍵作用，并且在纖維化的始動過程EMT的發(fā)生中也起到重要促進作用。MICRNASMIRNA屬于功能性非編碼RNA，通過降解目標MRNA或抑制其翻譯調(diào)節(jié)基因轉錄后水平的表達，參與調(diào)控生長發(fā)育，細胞分化、增殖、凋亡，腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展，是目前生命科學領域的研究熱點。有研究證實MIRNA是TGFΒ1誘導EMT的重要調(diào)節(jié)因子，如MIRNA200家族和MIRNA205。但是，MIRNA在腹膜纖維化領域的研究尚未見文獻報道。近期，我們采用高通道MIRNA芯片技術對PD病人腹透流出液腹膜間皮細胞MIRNA的表達進行了圖譜分析，發(fā)現(xiàn)MIRNA的異常表達與PD患者腹膜EMT及纖維化密切相關。隨著基因治療技術及基因載體系統(tǒng)的發(fā)展，對于PD患者腹膜纖維化的分子機制和干預治療研究取得了進一步的發(fā)展，大量在PD的動物模型中進行的基因治療研究證實了基因治療方法在腹膜纖維化機制研究和治療中的可行性。慢病毒載體LENTIVIRALVECT，LV作為目前被廣泛應用的基因載體，具有轉染效率高，插入外源基因容量大，能感染分裂期和非分裂期細胞，并且不會引起明顯免疫和炎癥反應等優(yōu)勢，將其應用于腹膜纖維化的研究十分有意義?；谝陨戏治觯覀冋J為某些MIRNA可參與調(diào)節(jié)腹膜間皮細胞EMT，以慢病毒載體為基因轉染工具，從MIRNA著手研究其在PD過程中EMT及纖維化的作用及分子機制具有重要的理論和現(xiàn)實意義。第一章腹腔注射慢病毒轉染小鼠腹膜間皮細胞效應的研究目的通過小鼠腹腔注射不同滴度的攜帶綠色熒光蛋白GREENFLUESCENCEPROTEIN，GFP基因的慢病毒，觀察其轉染小鼠腹膜間皮細胞的效應，探討腹腔注射慢病毒轉染小鼠腹膜間皮細胞最佳效應滴度。方法12周齡ICR雄性小鼠，體重2830克。隨機分為對照組N5、LVGFP1組N5、LVGFP2組N5、LVGFP3組N5。分別一次腹腔注射15ML09％生理鹽水或者不同滴度的慢病毒。于第28天處死小鼠，壁層腹膜用于HE和MASSON染色觀察腹膜形態(tài)變化、冰凍切片觀察GFP表達，臟層腹膜用于提取組織MRNA和蛋白，采用REALTIMEPCR和WESTERNBLOT方法檢測GFPMRNA和蛋白表達。結果1倒置熒光顯微鏡觀察小鼠腹膜組織冰凍切片，與對照組相比，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織有GFP表達2小鼠腹膜組織石蠟切片HE、MASSON染色觀察與對照組相比，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織形態(tài)學無明顯改變3REALTIMEPCR和WESTERNBLOT的方法檢測，腹腔注射慢病毒小鼠腹膜組織有GFPMRNA和蛋白表達4使用2108GTULVGFP組的轉染效率高于108GTULVGFP組，而與3108GTULVGFP組轉染效率差異不大。結論腹腔注射慢病毒能安全有效轉染小鼠腹膜組織，2108GTU為最佳效應滴度。第二章MIRNA302C在腹膜透析小鼠腹膜間皮細胞EMT中的作用與機制目的利用慢病毒載體將MIRNA302C導入PD小鼠腹膜組織，研究MIRNA302C在PD小鼠腹膜間皮細胞EMT中的作用與機制。方法12周齡ICR雄性小鼠，體重2830克。隨機分為空白對照組N5腹腔注射15ML09％生理鹽水，每天一次28天PDF組N5腹腔注射15ML含425％葡萄糖的標準腹透液，每天一次28天LVMMUMIRNA302CPDF組N5腹腔注射15ML含2108GTU的LVMMUMIRNA302C，第三天開始腹腔注射15ML含425％葡萄糖的標準腹膜透析液，每天一次28天LVPGIPZPDF組腹腔注射15ML含2108GTU的LVPGIPZ，第三天開始腹腔注射15ML含425％葡萄糖的標準腹膜透析液，每天一次28天。于第28天處死小鼠，壁層腹膜用于制作石蠟切片HE和MASSON染色觀察腹膜形態(tài)變化、冰凍切片觀察GFP表達，臟層腹膜用于提取組織蛋白和MRNA，并采用WESTERNBLOT、REALTIMEPCR等方法檢測MIRNA302C、ECADHERIN、ΑSMA、COLLAGENⅠ、CTGF的表達。結果1小鼠腹膜組織石蠟切片HE、MASSON染色觀察，與空白對照組相比，PDF組小鼠腹膜組織可見EMT的形態(tài)變化，而LVMMUMIR302CPDF組腹膜組織形態(tài)學變化介于空白對照組和PDF組之間，EMT改變較PDF組減輕2TAQMAN探針實時熒光定量REALTIMEPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，腹腔注射425％PDF的各組小鼠臟層腹膜組織MIRNA302C表達均有下調(diào)，LVMMUMIR302CPDF組較PDF組MIRNA302C表達增高3REALTIMEPCR、WESTERNBLOT證實每天腹腔注射425％PDF15ML，連續(xù)28天，可引起小鼠腹膜組織EMT，ECADHERIN表達減少，ΑSMA及COLLAGENⅠ表達增高。而LVMMUMIR302C轉染上調(diào)MIRNA302C可抑制腹透小鼠腹膜組織ΑSMA、COLLAGENⅠ表達增加，ECADHERIN表達降低與空白對照組相比，各組腹透小鼠腹膜組織CTGF表達均有上調(diào)，LVMMUMIR302CPDF組較PDF組CTGF表達降低。結論高糖腹透液可引起小鼠腹膜間皮細胞EMTLVMMUMIR302C可有效轉染小鼠腹膜上調(diào)MIRNA302C的表達，抑制CTGF表達，減輕腹透小鼠腹膜間皮細胞EMT。第三章MIRNA302C調(diào)控TGFΒ1誘導的腹膜間皮細胞EMT形成的機理目的通過觀察慢病毒介導的MIRNA302C對TGFΒ1誘導人腹膜間皮細胞HUMANPERITONEALMESOTHELIALCELLS，HPMCSEMT過程中CTGF表達的影響，探討MIRNA302C調(diào)控TGFΒ1誘導的HPMCSEMT形成的機制。方法常規(guī)培養(yǎng)正常HPMCS，隨機分為空白對照組不加任何干預TGFΒ1組用5NGMLTGFΒ1刺激48小時LVHSAMIR302CTGFΒ1組轉染載有MIRNA302C的慢病毒LVHSAMIR302C后，用5NGMLTGFΒ1刺激48小時LVPGIPZTGFΒ1組轉染載有對照質(zhì)粒PGIPZ的慢病毒LVPGIPZ后，用5NGMLTGFΒ1刺激48小時。采用熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白表達以判斷病毒轉染效率。采用WESTERNBLOT、REALTIMEPCR等方法分別檢測MIRNA302C、ECADHERIN、ΑSMA、COLLAGENⅠ、CTGF等在HPMCS中的表達變化及其相互關系。結果1TAQMAN探針實時熒光定量REALTIMEPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，TGFΒ1刺激的各組腹膜間皮細胞MIRNA302C表達均有下調(diào)，LVHSAMIR302CTGFΒ1組MIRNA302C表達較TGFΒ1組增高2HPMCS經(jīng)5NGMLTGFΒ1刺激48小時后，細胞出現(xiàn)成纖維樣細胞形態(tài)改變，而LVHSAMIR302CTGFΒ1組細胞形態(tài)變化介于空白對照組和TGFΒ1組之間，細胞EMT形態(tài)改變較TGFΒ1組減輕3REALTIMEPCR、WESTERNBLOT證實5NGMLTGFΒ1刺激48H可引起HPMCSEMT，ECADHERIN表達減少，ΑSMA及COLLAGENⅠ表達增高而LVHSAMIR302C轉染上調(diào)MIR302C可抑制TGFΒ1誘導的ΑSMA、COLLAGENⅠ表達增加，ECADHERIN表達降低與空白對照組相比，TGFΒ1刺激的各組腹膜間皮細胞CTGF表達均有上調(diào)，LVHSAMIR302CTGFΒ1組CTGF表達較TGFΒ1組降低。結論TGFΒ1可誘導HPMCSEMTLVHSAMIR302C轉染上調(diào)HPMCSMIRNA302C表達，抑制CTGF表達，減輕TGFΒ1誘導的HPMCSEMT。

簡介：目的為了觀察攜帶HIL10基因的非增殖型腺病毒對低溫大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用。方法構建SD大鼠原位肝移植模型。分為3組，72H后各組行肝移植。灌注后，留標本。WESTERNBLOT法檢測總IΚBΑ蛋白，EMSA法檢測NFΚB活性。ELISA檢測血清中RIL1Β，RTNFΑ及HIL10表達。觀察肝臟中EGFP的表達情況，RTPCR法檢測肝組織內(nèi)RIL1ΒMRNA，RTNFΑMRNA及HIL10MRNA的表達；觀察移植后再灌注肝細胞的組織變化。結果實驗組大鼠血清和肝組織內(nèi)均有較高水平的HIL10的表達。肝功能生化檢查及肝組織形態(tài)變化減輕，NFΚB活性較低。血清中RIL1Β，RTNFΑ和肝組織內(nèi)的RIL1ΒMRNA，RTNFΑMRNA表達均較對照組水平明顯降低。結論攜帶HIL10的非增殖型腺病毒對大鼠低溫肝缺血再灌注損傷有保護作用。

簡介：分類編號密級單位代碼QQ魚量學號QQQ三QQ天滓3|幣苊大學研究生學位論文論文題目社會博弈中合作與沖突結果評價的認知神經(jīng)機制學生姓名塞熊申請學位級別譴申請專業(yè)名稱基礎墜理堂研究方向社會達翅皇迭筮指導教師姓名王童塞專業(yè)技術職稱麴拯提交論文日期2Q壘生5旦天津師范大學博士學位論文原創(chuàng)聲明本人鄭重聲明此處所提交的博士學位論文社會博弈中合作與沖突結果評價的認知神經(jīng)機制，是本人在導師指導下，在天津師范大學攻讀博士學位期間獨立進行研究工作所取得的成果。據(jù)本人所知，論文中除已注明部分外不包含他人己發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究工作做出的重要貢獻的個人和集體，均己在文中以明確的方式注明。本聲明的法律結果將完全由本人承擔。作者簽名露搏日期沙一年F月多日天津師范大學博士學位論文使用授權書社會博弈中合作與沖突結果評價的認知神經(jīng)機制系本人在天津師范大學攻讀博士學位期間在導師指導下完成的博士學位論文。本論文的研究成果歸天津師范大學所有，本論文的研究內(nèi)容不得以其他單位的名義發(fā)表。本人完全了解天津師范大學關于保存、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留并向有關部門送交論文的復印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱，同意學校將論文加入中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫和編入中國知識資源總庫。本人授權天津師范大學，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文，可以公布論文的全部或部分內(nèi)容。本學位論文屬于請在以下相應方框內(nèi)打“√”；保密口，在年解密后適用于本授權書不保密口作者簽名專礴日期加嬸年占月ET導師簽名擻日期7TT尸年∥月日