黃羽扇豆懷特酮對SH-SY5Y細胞的防癌抗癌作用機制研究.pdf

1、黃羽扇豆懷特酮(以下簡稱Lup)是一種具抗腫瘤活性的天然產物，屬于異黃酮類化合物。目前經研究證實了異黃酮類物質具有抗癌抗氧化方面的活性。但關于 Lup的藥理效應和活性機制很少報道。本論文對本實驗室合成Lup主要通過以細胞凋亡途徑探究抗癌機制和以Nrf2為靶點研究抗氧化、防癌機制。研究其是否為療效好，毒副作用低的防癌抗癌活性化合物。
　　PI3K/Akt途徑探究抗癌機制：利用MTT法檢測Lup對SH-SY5Y、Vero和HUVEC細

2、胞的毒活性，并研究Lup作用于SH-SY5Y細胞24、48和72小時后的增殖抑制率，結果表明，Lup表現(xiàn)出較高的細胞增殖抑制活性且呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性。進一步的研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的化合物Lup處理SH-SY5Y細胞，經DAPI染色，利用流式細胞術(FCM)定量結果表明Lup能夠使SH-SY5Y細胞生長停留在G2/M期且Western blot印跡法檢測到相關周期蛋白Cyclin B1/D1和周期蛋白依賴性激酶CDK1/2/4/6的表

3、達也下調。Lup處理后的細胞經AnnexinⅤ-FITC/PI熒光雙染后通過FCM分析凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Lup可誘導發(fā)生凋亡。在顯微鏡下拍照分析經Hoechst33258處理的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)Lup處理的SH-SY5Y細胞染色質皺縮，且出現(xiàn)凋亡的典型特征凋亡小體。同時western blot結果表明Lup可誘導SH-SY5Y細胞的PI3K/Akt途徑中相關凋亡蛋白表達發(fā)生變化，Lup能使p-Akt、Bcl-2、procaspase9、PARP

4、-1的表達水平下降，上調Bax、cytochrome c、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1蛋白的表達。此外，凋亡出現(xiàn)的時候常常會伴隨著線粒體膜電位(ΔΨm)崩潰及其內部ROS的增加，F(xiàn)CM分析檢測到經Rhodamine123染色Lup可以引起ΔΨm的缺失和利用DCFH-DA探針發(fā)現(xiàn)其能增加細胞內ROS的生產。
　　Nrf2為靶點探究防癌機制：核轉錄因子Nrf2介導

5、的抗氧化信號通路在預防癌癥上是關鍵的靶向基因。利用Western blot檢測不同濃度的化合物Lup處理細胞后，SH-SY5Y細胞中的Nrf2與Keap1蛋白表達的變化，以及對細胞核中的Nrf2蛋白表達影響，發(fā)現(xiàn)Lup能使Keap1蛋白的表達降低，增加全細胞和核內Nrf2蛋白的表達。通過免疫熒光實驗檢測Lup對 Nrf2基因從胞漿到胞核遷移的作用，結果顯示隨著給藥濃度的增加Nrf2向核內遷移的數量增多。隨后通過ARE-GFP報告因子檢測