TSC1和TSC2蛋白的表達、純化和性質探討.pdf

1、結節(jié)性硬化癥（Tuberous Sclerosis Complex，TSC）是一種在多器官發(fā)生良性腫瘤的常染色體顯性疾病。該疾病表現(xiàn)出多種臨床病癥，如癲癇、自閉癥、腎血管平滑肌瘤等。結節(jié)性硬化癥由腫瘤抑制基因TSC1和TSC2發(fā)生突變所致，不同突變導致的病癥和嚴重程度都不同。這兩個基因分別編碼的TSC1和TSC2蛋白形成 TSC1/2復合物，在mTOR信號通路中起到負調控的作用。TSC1/2復合能夠整合上游的氨基酸、生長因子、能量、低氧

2、和細胞因子等生長信號，轉化為 TSC1和TSC2不同位點的磷酸化狀態(tài)。TSC2的GTP酶激活蛋白（GAP）結構域活化Rheb（Ras homolog enriched in brain GTPase），從而抑制mTORC1（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1，mammalian target of rapamycin complex1）的活性，降低細胞的合成代謝水平。該復合物的結構學研究有助于揭示其調控機理。
　　本研究表達和純化人和

3、裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe（S. pombe）的TSC1和TSC2蛋白，進行結晶嘗試。我們利用大腸桿菌Escherichia coli（E. coli）表達TSC1的coiled coil結構域和TSC2的GAP結構域，裂殖酵母TSC1540-675 aa的MBP（麥芽糖結合蛋白）融合蛋白表達較好，但聚合度高；TSC2完整的GAP結構域沉淀，人TSC21516-1708 aa可溶，但與人Rheb共點晶不

4、結晶。用昆蟲細胞Sf9共表達裂殖酵母TSC1和TSC2蛋白，TSC1全長（TSC1 FL）和TSC2全長（TSC2 FL）表達量低；TSC1的C端截短，如1-799 aa、1-718 aa表達量較高；TSC2的C端截短表達量不如TSC2 FL；Anti-Flag親和純化Flag-TSC2同時拉出His-TSC1，可得到純度高的TSC1/2復合物，解決了TSC1表達量高于TSC2的問題；TSC1需要一定長度的coiled coil來穩(wěn)定T

5、SC2，部分C端截短的TSC11-718 aa或1-799 aa和TSC2 FL共表達有利于提高TSC2的表達量。裂殖酵母TSC1以二聚體的形式存在；TSC1結合TSC2，TSC1/2復合物會聚合成分子量大于1 MDa的多聚體；TSC2的N端和GAP結構域可以分開，TSC1和TSC2的N端結合。Expi293F表達系統(tǒng)適合人TSC1 FL和TSC2 FL的表達，但表達量較低，截短蛋白的表達情況不如全長?？傊?，本研究對 TSC1和TSC2