人牙囊細胞生物學特性及定向誘導分化的實驗研究.pdf

1、研究背景牙周組織缺損最理想的愈合方式是達到牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜完全的功能性再生。牙周組織再生的基礎是牙周膜細胞(PDLCs)，但在某些類型牙周病損部位，PDLCs的來源非常有限，以致牙周組織很難達到有效的再生和重建，而組織工程技術有望解決這一難題。組織工程學是近年來發(fā)展起來的一門新學科，其基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關的活細胞種植到具有一定空間結(jié)構(gòu)的三維支架上，再將此細胞支架復合物植入體內(nèi)，或在體外繼續(xù)培養(yǎng)，通過細胞之間的相互

2、粘附、生長繁殖分泌細胞外基質(zhì)，從而形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的初級組織或器官后植入體內(nèi)，以達到修復創(chuàng)傷和重建功能的目的。 牙周組織的形成和重建過程中同時有三種重要細胞參與：成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞，完全意義上的牙周再生應達到牙槽骨、牙周膜、牙骨質(zhì)的同時再生，使得牙周組織工程具有其特殊性及較大的難度，特別是牙骨質(zhì)的再生是其決定性的因素。目前用于牙周組織工程研究的種子細胞主要有牙周膜細胞、骨髓基質(zhì)細胞、成牙骨質(zhì)細胞、胚胎來源干

3、細胞、基因轉(zhuǎn)染牙齦成纖維細胞等。 在牙齒發(fā)育過程中，牙周組織由牙囊細胞發(fā)育分化而來，牙囊中含有成牙骨質(zhì)、成纖維、成骨細胞的前體細胞成份，在一定的誘導條件和環(huán)境作用下牙囊細胞可以向成牙骨質(zhì)、成骨細胞方向轉(zhuǎn)化。來源于上皮根鞘的釉基質(zhì)蛋白(EMPs)被認為在牙囊向牙周細胞特別是成牙骨質(zhì)細胞的發(fā)育分化中起重要的調(diào)控作用，骨形成蛋白-2(BMP-2)是BMP家族中誘骨活性最強的一種，在牙齒發(fā)育早期為活躍的調(diào)控因子之一。目前已有研究證實，體

4、外條件下，EMPs或BMP-2均能影響牙囊細胞的生物學行為，并能誘導其向成骨、成牙骨質(zhì)細胞方向分化。因此，利用牙囊細胞體外培養(yǎng)，經(jīng)過誘導因子(如EMPs、BMP-2)的作用，使其具有牙骨質(zhì)、成骨細胞的分化趨勢后作為種子細胞用于牙周再生研究，理論上是可行的。此外，分離培養(yǎng)牙囊細胞了解其生物學特性，深入開展牙囊向牙周組織分化過程的分子機制、影響因素和調(diào)控方式的研究，不僅可能為牙周病的修復再生機制提供一些有利的思路，為牙周組織工程研究提供一些

5、理論基礎和依據(jù)，更重要的是對于豐富牙周和牙胚發(fā)育生物學理論亦起著至關重要的作用。目前研究中，多局限于牙囊細胞在牙胚發(fā)育及牙齒萌出過程中的調(diào)控機制，很少將牙囊細胞運用于組織工程研究的報道。 研究目的研究牙囊細胞的生物學特性及其向牙周組織發(fā)育分化的機制，為牙周組織工程研究提供理論基礎。分離培養(yǎng)人牙囊細胞，初步了解牙囊細胞特性及向牙周組織發(fā)育分化的機制；通過檢測細胞增殖活性、堿性磷酸酶活性及礦化能力、蛋白合成變化等，探討EMPs和BM

6、P-2促牙囊細胞分化的細胞學機理，進一步認識其生物學特性；運用三種不同載體對牙囊細胞進行三維培養(yǎng)，建立細胞/載體復合物，探討三種載體作為組織工程支架的可行性；初步嘗試將牙囊細胞及EMP、BMP-2應用于體外牙周組織工程研究。 研究方法一、HDFC的分離培養(yǎng)及生物學特性分離合法引產(chǎn)胎兒牙胚根部的牙囊組織，運用酶消化結(jié)合組織塊法獲得HDFC，進行細胞形態(tài)學觀察、描繪細胞生長曲線，并運用免疫細胞方法、RT-PCR技術對細胞進行生物學特

7、性鑒定，體外礦化培養(yǎng)觀察細胞礦化能力。 二、HDFC體外定向誘導分化的實驗研究運用細胞生物學MTT檢測法、酶動力學法、動態(tài)觀察礦化結(jié)節(jié)形成法、免疫細胞化學及圖像分析技術等檢測手段，觀察EMPs、BMP-2單獨或聯(lián)合應用對體外培養(yǎng)的HDFC增殖、分化、礦化能力及礦化相關蛋白分泌等生物學特性的影響，通過免疫細胞化學方法檢測EMPs、BMP-2作用于HDFC對牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)表達的影響，探討上述兩種生長因子是否對牙囊細胞的分化

8、起誘導作用。 三、HDFC復層化及三維立體培養(yǎng)模型的建立將HDFC進行復層化培養(yǎng)獲得組織工程載體，利用Ⅰ型膠原凝膠載體、烏賊骨轉(zhuǎn)化羥基磷灰石載體對HDFC進行體外三維立體培養(yǎng)并構(gòu)建細胞/載體復合體，行裸鼠皮下種植，光鏡下、電鏡下觀察材料與細胞之間的相容性，通過組織學觀察評價三種載體復合HDFC在體內(nèi)自發(fā)分化情況。 結(jié)果一、分離培養(yǎng)HDFC及其生物學特性：運用酶消化結(jié)合組織塊法能高效率獲得HDFC，細胞為成纖維細胞形態(tài)；免

9、疫細胞化學染色抗波形絲蛋白VIM(++)、抗角蛋白CK(-)，說明細胞來源于外胚間充質(zhì)，礦化相關蛋白COLⅠ、COLⅢ、BSP、OPN、ON為中度陽性到弱陽性表達。RT-PCR結(jié)果顯示：HDFC中骨涎蛋白(BSP)、骨鈣素(OCN)、堿性磷酸酶(ALP)、mcpr1為低到中度表達，在不同分子量片段處呈現(xiàn)為不同灰度值的特異性條帶，未檢測到牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)和核心結(jié)合因子α1(cbfa1)的表達；體外礦化條件下培養(yǎng)的HDFC在20天

10、時可觀察到細小的顆粒狀礦化結(jié)節(jié)形成，30天時Vonkossa染色(+)。 二、EMPs和BMP-2對HDFC體外定向誘導分化結(jié)果：1.50、100、200mg/L的EMPs，50、100、200ug/LBMP-2對HDFC起促增殖作用。其中EMPs100mg/L、BMP-2100ug/L的濃度為最佳促增殖濃度，并且這種促增殖效應從第3d起即顯效，可一直持續(xù)至第7d。在聯(lián)合應用EMPs和BMP-2時，對HDFC亦具有顯著促增殖作用

11、，但聯(lián)合應用二者對牙囊細胞的增殖活性的影響不存在協(xié)同或拮抗作用(P＞0.05)。 2.100、200mg/L的EMPs，25、50、100、200ug/L的BMP-2均可明顯促進細胞分泌ALP，這種促進作用在第3d時即出現(xiàn)。聯(lián)合應用二者時亦能促進HDFC分泌ALP，并且聯(lián)合應用對HDFC的促ALP分泌起協(xié)同作用(與單獨應用相比P＜0.05)；觀察EMPs、BMP-2對細胞礦化結(jié)節(jié)形成能力的影響：在礦化培養(yǎng)液中添加100ug/L的

12、BMP-2、100ug/L的BMP-2+100mg/L的EMPs均可加快牙囊細胞礦化結(jié)節(jié)的形成，而單獨加入100mg/L的EMPs對牙囊細胞的礦化結(jié)節(jié)形成能力無明顯影響。 3.HDFC在無外界刺激因素作用下其分泌膠原蛋白COLⅠ的能力可隨時間延長而增加(表現(xiàn)為免疫組化染色加深，灰度值減小，P＜0.05)，而分泌COLⅢ、BSP、OPN、ON的能力無變化(P＞0.05)；利用100mg/LEMPs和100ug/LBMP-2誘導HD

13、FC，均顯著促進細胞分泌COLⅠ、COLⅢ、BSP、OPN、ON，表現(xiàn)為染色加深，灰度值下降，在3d時這些指標的表達即已顯著升高(P＜0.01)，并隨時間延長這種促進分泌作用日益明顯(7d時灰度值與3d組相比P＜0.01)。 4.在對不同誘導因子作用于HDFC后對其CAP表達影響的檢測中，100ug/LBMP-2作用HDFC7d時抗CAP染色為陽性，而100mg/LEMPs作用細胞未能檢測到CAP的表達。 三、利用復層化

14、細胞、Ⅰ型膠原、烏賊骨轉(zhuǎn)化羥基磷灰石載體建立細胞/載體復合物：組織學切片、顯微鏡、電鏡觀察均顯示，細胞在三種載體內(nèi)生長狀態(tài)良好，三種載體均具有良好的細胞相容性。裸鼠皮下種植組織學切片表明，僅復層化植入組觀察到了少量類礦化基質(zhì)形成，但免疫組化牙骨質(zhì)附著蛋白抗體染色為陰性。 結(jié)論1.酶消化結(jié)合組織塊法可獲得HDFC，具有一定的成骨/成牙骨質(zhì)細胞特性。 2.EMPs、BMP-2可影響HDFC的增殖、分化、調(diào)節(jié)其蛋白合成，在HD