Melamine導致大鼠認知損傷的機制研究和VC與VE聯(lián)用的可能治療.pdf

1、Melamine（1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺），是一種重要的化工原料，常被用來生產三聚氰胺樹脂與甲醛反應，用于生產塑料、粘合劑和面料等。盡管在很長一段時間內，三聚氰胺被準許可參與食品接觸產品（如食品包裝材料和餐具）的生產過程，但它不是食品添加劑，更沒有允許直接添加到食品中。
　　Melamine的毒理學研究起始于1984年。然而，當時melamine的潛在毒性并沒有引起公眾的關注。大量的實驗結果表明，嬰兒或動物食用含mel

2、amine的食品后會導致嚴重的損傷，其中腎臟是其作用的主要靶器官。本實驗室以前的研究表明，melamine可能損害海馬錐體神經元功能和誘導神經細胞凋亡，并在細胞學實驗中發(fā)現(xiàn)其氧化損傷作用。顯然，melamine誘發(fā)的腎毒性并不能完全解釋其神經毒性效應。
　　另一方面，melamine引發(fā)的毒性報道逐漸減少。但仍然未知服用melamine后是否會影響嬰幼兒的中樞發(fā)育，甚至其毒性是否會影響成年后的認知等。抗氧化劑能夠減少氧化應激，并緩

3、解中樞神經系統(tǒng)功能的影響。維生素C和維生素E是兩種重要的營養(yǎng)物質。它們能及時分解自由基，抵御異常增加的自由基的攻擊，保護細胞正常的內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。聯(lián)合使用維生素C和E能緩解阿爾茲海默癥、帕金森癥、肌萎縮性脊髓側索硬化癥以及共濟運動失調等誘發(fā)的氧化損傷、焦慮和認知行為缺陷等，提高日常生活質量。
　　基于以上研究背景，本實驗主要探討慢性口服melamine對空間認知和海馬突觸可塑性的影響。同時，檢測海馬內自由基和抗氧化酶活性的變化。最后，

4、通過服用抗氧化維生素C和E對melamine引起的氧化損傷進行恢復性治療，并探討其可能機制。
　　第一部分Melamine對空間認知和海馬突觸可塑性的影響
　　目的:探討melamine對Wistar大鼠的空間認知能力和海馬突觸可塑性的影響，并進一步揭示其可能的生理機制。
　　材料與方法:大鼠隨機分成兩組:正常對照組(n=16)和Melamine(n=16)組。采用口服方式給予大鼠melamine懸濁液，每日一次。28

5、天后，進行Morris水迷宮實驗檢測melamine對大鼠的空間認知能力的影響，包括學習、記憶和再獲取能力。記錄大鼠海馬Schaffer側枝到CA1區(qū)的突觸傳遞可塑性變化，包括LTP和LTD。采用酶標法檢測口服melamine后大鼠海馬內melamine含量變化。
　　結果:
　　1、ELISA檢測結果顯示:大鼠口服melamine28天后，海馬內melamine含量異常增加，說明melamine能夠通過血腦屏障，并在海馬內

6、積累。
　　2、Morris水迷宮實驗顯示:在學習和再獲取學習階段，melamine損傷大鼠逃避潛伏期明顯增加;在空間探索階段，目標象限停留時間比率和穿越目標平臺次數(shù)也明顯減少。說明慢性口服melamine能損傷大鼠空間認知能力，包括學習，參考記憶和再獲取能力。
　　3、電生理記錄實驗結果顯示:服用melamine后，LTP實驗記錄的場電位斜率明顯低于正常組;而LTD實驗記錄的場電位斜率明顯高于正常組。實驗結果表明長期口服m

7、elamine會導致大鼠海馬突觸可塑性的損傷。
　　結論:melamine能夠通過血腦屏障進入大腦，并在海馬腦區(qū)積累。Melamine導致海馬長時程突觸可塑性損傷，最終導致認知能力，特別是認知彈性損傷。
　　第二部分Melamine導致大鼠空間認知損傷與誘發(fā)海馬氧化應激相關
　　目的:為證實melamine導致空間認知損傷是否與破壞海馬內氧化與抗氧化穩(wěn)態(tài)相關。
　　方法:大鼠分為正常對照組(n=8)和Melami

8、ne（n=8）組。采用口服方式給予大鼠melamine懸濁液，每日一次。28天之后，進行Morris水迷宮實驗檢測了melamine對空間認知能力的影響以及海馬內自由基、MDA、SOD和ATP水平。
　　結果:
　　1、慢性口服melamine4周中，大鼠體重增加量明顯減少。同時，海馬內melamine濃度異常增加。
　　2、水迷宮實驗結果表示:在學習階段，melamine損傷大鼠逃避潛伏期明顯延長，在空間記憶階段，其

9、目標象限停留百分比和目標平臺穿越次數(shù)均明顯減少。
　　3、組織學HE染色結果表明:melamine導致海馬神經元染色明顯加深，細胞核固縮，細胞松散，細胞質減少，出現(xiàn)大量壞死現(xiàn)象。
　　4、生化檢測試驗表明:慢性口服melamine會增加海馬內自由基、MDA和ATP含量，同時降低抗氧化酶活性，如SOD和GSH-Px。
　　結論:Melamine在海馬的神經毒性與氧化應激有關。
　　第三部分VC與VE聯(lián)合對melam

10、ine導致的PC12細胞氧化應激的恢復作用
　　目的:探討單獨使用VC、VE或聯(lián)合使用vitamin對melamine在PC12細胞引起的氧化應激的恢復作用。
　　方法:利用PC12細胞建立離體melamine損傷模型。MTT法檢測細胞存活率。流式細胞計數(shù)法檢測PC12細胞凋亡和胞內自由基數(shù)目。通過Hoechst33342染色觀察細胞凋亡形態(tài)學變化。生化檢測抗氧化酶系統(tǒng)在恢復前后的改變。
　　結果:
　　1、Me

11、lamine損傷后，單獨使用VC、VE或聯(lián)合使用vitamin均能一定程度上恢復細胞存活率，但聯(lián)合使用維生素更具有優(yōu)勢。
　　2、聯(lián)合維生素能有效地減少自由基的異常積累，降低MDA水平，幫恢復抗氧化酶活性，如SOD，CAT和GSH-Px。
　　3、Hoechst33342染色和流式細胞計數(shù)法結果顯示:melamine能明顯誘發(fā)細胞凋亡，并且聯(lián)合vitamin能有效減少凋亡細胞數(shù)目。
　　4、聯(lián)合使用vitamin通過抑

12、制caspase-3活性抑制細胞凋亡的發(fā)生。
　　結論:聯(lián)合VC和VE能有效降低melamine誘發(fā)的氧化損傷，并抑制細胞凋亡。
　　第四部分VC與VE聯(lián)用對melamine誘發(fā)的認知損傷的保護作用及機制研究
　　目的:探討聯(lián)合使用VC和VE對melamine損傷大鼠認知功能的恢復作用及其機制，包括氧化損傷和海馬突觸可塑性。
　　材料與方法:三周雄性大鼠隨機分成四組:正常對照組(n=16)，melamine（n=

13、16），melamine+vitamin組(n=16)和vitamin組(n=16)。采用口服方式給予melamine懸濁液，每日一次，建立melamine損傷動物模型。隨后，給予一周聯(lián)合維生素C和E，腹腔注射每日一次。Morris水迷宮實驗檢測了大鼠空間認知能力變化。組織學HE染色觀察海馬錐體神經元形態(tài)變化。記錄大鼠海馬Schaffer側枝到CA1區(qū)的突觸可塑性變化，包括LTP和LTD。采用酶標法檢測大鼠海馬內自由基、MDA、NO和抗

14、氧化劑和凋亡相關酶活性的變化等。
　　結果:
　　1、聯(lián)合使用VC和VE能恢復大鼠空間認知損傷，包括能有效的改善學習和參考記憶能力，并一定程度上緩解再學習能力。
　　2、組織學觀察發(fā)現(xiàn):聯(lián)合vitamin能有效減少melamine導致的細胞壞死等損傷。
　　3、電生理實驗結果顯示:melamine會導致大鼠海馬突觸長時程可塑性的損傷。
　　聯(lián)合使用viatamin能緩解海馬突觸可塑性損傷，包括LTP和LTD

15、。
　　4、Melamine損傷大鼠注射VC和VE后，海馬中自由基、MDA和NO含量恢復到正常水平。SOD、CAT、GSH-Px和NOS的活性也明顯提高。神經元凋亡相關蛋白Bcl-2和caspase-3的活性也明顯提高。
　　結論:聯(lián)合VC和VE通過干預氧化損傷過程，降低melamine誘發(fā)的神經毒性，為治愈melamine導致的認知損傷提供了新的可能依據。
　　第五部分慢性孕期酒精導致大鼠性別二態(tài)性的空間認知和突觸可

16、塑性平衡損傷
　　目的:探討孕期酒精性別二態(tài)性的認知行為變化，應用突觸可塑性平衡探討空間認知損傷的機制。
　　材料與方法:母鼠在妊娠期口服酒精并選取其雌雄后代進行實驗。出生后36天后代大鼠進行MWM實驗來檢測其空間認知功能變化，記錄其海馬Schaffer側枝到CA1區(qū)的突觸可塑性變化。用方向指數(shù)衡量雌雄大鼠突觸可塑性平衡的差異，進一步揭示其性別二態(tài)性。
　　結果:
　　1、CPEE使后代大鼠體重增加明顯減少，同時

17、導致頭小畸形和海馬重量減輕。
　　2、Morris水迷宮實驗顯示:CPEE后代大鼠的逃避潛伏期明顯增加，并且其趨壁性明顯增多。在探索階段，CPEE后代大鼠在目標象限停留時間百分比和目標平臺穿越次數(shù)均明顯減少。此外，雌性后代比雄性后代認知損傷更嚴重。
　　3、電生理實驗結果顯示:CPEE導致雄性后代LTP明顯降低而去增益明顯增強;而雌性LTP明顯增強而去增益明顯減弱。此外，雌性后代的損傷程度更嚴重。
　　4、方向指數(shù)進一