載TCG-β3基因的自組裝肽支架與前軟骨干細胞體外成軟骨效應的研究.pdf

1、目的：
　　 為研究關節(jié)軟骨與骺板損傷的基因治療創(chuàng)造條件，構建人轉化生長因子β3（TGF-β3）的真核表達載體，并轉染大鼠前軟骨干細胞(PSCs)，以獲得組織工程的種子細胞。探討穩(wěn)定表達重組TGF-β3對前軟骨干細胞（PSCs）增殖及向成軟骨方向定向分化的誘導作用。通過將軟骨誘導活性的TGF-β3基因非共價結合于自組裝多肽凝膠組織工程支架基質材料上，制備具有軟骨誘導活性的新型基因活性基質材料（GAM），以促進種子細胞定向分化。對

2、比基因強化組織工程的不同方法研究載基因介質與轉基因介質對成軟骨誘導分化的體外研究，來評價其成軟骨誘導作用。
　　 方法：
　　 (1)基因工程的方法重組構建pcDNA3.1(+)-hTGF-β3 真核表達載體并鑒定：通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增編碼hTGF-β3的編碼序列（cds），在其啟動子上游加Xho I酶切位點，終止子下游加BamH I酶切位點，雙酶切載體pcDNA3.1(+)和hTGF-β3 片段，回收后T4

3、DNA 連接酶連接，連接產物轉化感受態(tài)DH5α，涂板孵育挑取陽性克隆，提取質粒，酶切、測序鑒定。
　　 (2)免疫磁珠法分離純化大鼠前軟骨干細胞：在手術顯微鏡下（310 倍）鈍性分離大鼠La Croix 環(huán)，采用三步酶消化法獲得含有PSCs的混合細胞。48 小時后，按操作說明采用免疫磁珠分選系統(tǒng)純化上述細胞，即可得到FGFR-3 陽性細胞。將細胞種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
　　 (3)納米級的高分子聚合物線性化的聚乙烯亞胺（PE

4、I）共轉染轉染：pcDNA3.1(+)-hTGF-β3與pcDNA3.1-EGFP，PEI和DNA混合的量的N/P 比5 左右，48 小時候終止轉染。
　　 (4)觀察和檢測瞬時轉染后的表達情況：轉染后48 小時，收獲細胞。提取總RNA，逆轉錄，PCR檢測TGF-β3表達情況。收集轉染后24hr，48hr，72hr，96hr，120hr時點轉染組細胞和未轉染組細胞培養(yǎng)上清液，采用雙抗體夾心ELISA法，以TGF-β3純品制作標準

5、曲線，測定轉染組與未轉染組各代細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β3 蛋白的濃度。
　　 (5)抗生素篩選穩(wěn)定表達TGF-β3 克?。?8h后終止轉染，更換含有G418的培養(yǎng)基進行穩(wěn)定篩選。至細胞陽性克隆形成后，挑取單克隆并擴大培養(yǎng)。
　　 (6)噻唑藍(MTT)檢測增殖情況：將轉染組和未轉染組細胞按每孔5.0×103的密度接種至96孔板中，分別于0，24，48，72，96h 加入濃度為5mg/ml MTT 20μl，置培養(yǎng)箱避光

6、孵育4h，然后棄上清，加入150μl的DMSO。振蕩充分溶解后，在酶標儀570nm波長度吸光度值，并繪制生長曲線。
　　 (7)流式細胞術測定轉染對PSCs增殖和DNA 合成的影響：收集第2 代細胞，分為未轉染組與轉染組，預處理后，上機檢測，測定細胞周期，觀察G1 期、S 期、G2 期細胞各占的百分比。
　　 (8)qRT-PCR檢測成軟骨基因表達情況：：收獲轉染組和未轉染組細胞細胞，提取總RNA，逆轉錄。使用GAPDH

7、作為內參照，實用Sybr Green法進行相對實時定量。
　　 相對轉錄水平通過比較Ct 來確定。Y=2-ΔΔCt,ΔΔCt=ΔE-ΔC，ΔE=Ct轉染組-CtGAPDH,ΔC=Ct未轉染組-CtGAPDH。
　　 (9)免疫組化及western blot的方法比較轉染后目的基因和軟骨特異性標志物表達的情況：取穩(wěn)定表達TGFβ3的PSCs和未轉染組細胞做爬片，用4 ℃固定液（丙酮：乙醇 1 ︰1）固定20min，免疫組化

8、，HE，番紅O等檢測。取轉染組和未轉染組細胞，提取細胞總蛋白質，用BCA法測定樣品蛋白濃度，取20ug總蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉移至硝酸纖維素膜，剪取相應條帶，加入用脫脂奶粉配成的1︰200 兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體或1 ︰100的兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體的抗體稀釋液，4 ℃封閉孵育過夜，PBS 洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1︰2000)，37 ℃振蕩孵育1h，漂洗后采用化

9、學發(fā)光發(fā)檢測，于暗室中曝光后洗片，掃描，灰度分析。
　　 (10)用固相法合成KLD-12 多肽并通過高壓液相色譜及質譜儀純化并鑒定；取0.5%（w/v）多肽在生理溶液條件自組裝成多肽凝膠裝物質，將TGF-β3 質粒與KLD-12 多肽間非共價鍵結合負載質粒并檢測其DNA 釋放能力。
　　 （11）實驗分四組，A組取轉染TGF-β3細胞與KLD-12混合，B組取PSCs細胞與載基因支架混合，C組取PSCs與KLD-12混

10、合，D組為KLD-12 支架。通過噻唑藍(MTT)法檢測細胞生長情況，qRT-PCR法檢測成軟骨基因表達情況Alcian Blue法檢測軟骨外基質sGAG含量。
　　 結果:
　　 (1)重組質粒經過酶切電泳，和測序證實構建成功，共轉染后在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，RT-PCR和Elisa可以檢測到有目的基因的表達。轉染后24h，上清液中TGF-β3含量即呈上升趨勢，在72h后逐漸下降。
　　 (2)hTG

11、F-β3 在分離純化的PSCs中穩(wěn)定表達。MTT結果顯示，2d內轉染組和未轉染組的增殖活性比較，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；隨著時間的延長，轉染組的增殖效率明顯高于未轉染組qRT-PCR結果顯示，轉染組軟骨特異的標志物基因表達都有不同程度的上升（p<0.05）。免疫組化學結果表明轉染后PSCs細胞外基質的染色增多并加深，并且出現軟骨細胞表型的表達，II型膠原染色也加深。Western blot檢測結果顯示，轉染組對軟骨表面標志II

12、型膠原（collagen type II）表達明顯增高，TGF-β3的表達也顯著增高，灰度值測量顯示差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　 (3)KLD-12 多肽序列合成成功，其相對分子質量為1 466.9；負載TGF-β3基因的自組裝肽凝膠支架的基因釋放DNA含量于3 d內達高峰，2 周內可維持在較高水平。
　　 (4)A組增殖能力始終要強于其他兩組，B組與C組之間的增殖能力差異在10d左右開始具有統(tǒng)計學意義（p<

13、0.05）。A組，B組隨著培養(yǎng)時間延長軟骨標志物基因上調明顯，與C組之間的差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05），軟骨外基質sGAG與DNA含量在A組，B組，C組之間的兩兩差異具有統(tǒng)計學意義。暗室中曝光后洗片，掃描，灰度分析。
　　 (10)用固相法合成KLD-12 多肽并通過高壓液相色譜及質譜儀純化并鑒定；取0.5%（w/v）多肽在生理溶液條件自組裝成多肽凝膠裝物質，將TGF-β3 質粒與KLD-12 多肽間非共價鍵結合負載質粒并檢

14、測其DNA 釋放能力。
　　 （11）實驗分四組，A組取轉染TGF-β3細胞與KLD-12混合，B組取PSCs細胞與載基因支架混合，C組取PSCs與KLD-12混合，D組為KLD-12 支架。通過噻唑藍(MTT)法檢測細胞生長情況，qRT-PCR法檢測成軟骨基因表達情況Alcian Blue法檢測軟骨外基質sGAG含量。
　　 結論：
　　 通過上述實驗，正確構建真核表達載體hTGF-β3的重組質粒，并成功轉染P

15、SCs，為軟骨組織工程的的基因強化研究提供了新的備選基因及種子細胞。通過壓力篩選后，獲得的hTGF-β3基因強化的PSCs的細胞株，可以穩(wěn)定表達高效的hTGF-β3 蛋白，從而促進PSCs的增殖并向成軟骨方向分化，為軟骨缺損的高效修復提供了新的手段。
　　 成功合成負載TGF-β3基因自組裝肽凝膠基質材料，并進行質粒釋放動力學檢測，該材料可在2 周左右保持較高的質粒釋放水平，有利與組織的修復?；驈娀幕|材料可以作為軟骨，骺板