人類博卡病毒非結構蛋白NS1、NP1重組桿狀病毒的制備及NP1核定位信號的初探.pdf

1、2005年，瑞典科學家Tobias Allander等利用隨機PCR、高通量測序和生物信息學的方法在下呼吸道被感染的嬰幼兒標本中發(fā)現(xiàn)一種新病毒，根據(jù)序列同源性將其命名為人類博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)。人類博卡病毒是一種二十面體對稱的細小病毒，直徑18-25nm，無囊膜，基因組以單鏈線性方式存在，大小約為5500bp。根據(jù)目前的分類系統(tǒng)，人類博卡病毒隸屬于博卡病毒屬，細小病毒亞科，細小病毒科。人類博卡病毒的基因組

2、主要有三個開放閱讀框，按5’到3’方向依次編碼非結構蛋白NS1、非結構蛋白NP1以及由重疊基因編碼的結構蛋白VP1和VP2。病毒感染細胞時，非結構蛋白NS1最先被轉錄和翻譯，病毒基因組的復制和表達需要NS1蛋白的調控。另一個非結構蛋白NP1作為博卡病毒屬特有的蛋白，功能還不明確，已有的研究表明其對犬細小病毒(MVC)的DNA復制具有重要作用。
　　 本課題根據(jù)人類博卡病毒基因組序列(NCBI GeneBank: GU139423

3、)設計多對引物擴增NS1抗原表位（C端1423-2172 nt:750 bp）、NS1全長、NP1全長基因及NP1截短基因。NP1和NS1全長基因克隆到已成功插入人類博卡病毒啟動子HBoV和EGFP基因的pFastBac1供體質粒上，將測序正確的pFB-BoV-EGFP、pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重組供體質粒轉化DH10Bac感受態(tài)細胞，72h后通過藍白斑篩選和酚氯仿抽提出正確的重組bacmid并轉染sf9細胞制備所需的重

4、組桿狀病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1; NS1抗原表位基因插入原核表達載體pMal-c2x上， IPTG誘導及過柱純化MBP融合蛋白，最后免疫小鼠制備抗NS1蛋白的多克隆抗體;利用NetPhos2.0 Server軟件分析NP1蛋白中能磷酸化的氨基酸所對應的堿基，設計引物PCR擴增具磷酸化位點和無磷酸化位點的NP1截短基因，克隆到真核表達載體pEGFP-N1后轉染HeLa細胞，48h后熒光顯微鏡下

5、觀察綠色熒光的分布，初步探究NP1蛋白的核定位信號。同時，將NP1截短基因插入另一真核表達載體pCDNA3.1(+)中，為探究NP1蛋白具體功能域做好克隆準備。
　　 Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重組桿狀病毒、NS1抗體的制備為探究人類博卡病毒非結構蛋白NS1、NP1的功能提供了豐富的科研材料;初步確定的非結構蛋白NP1在HeLa細胞中的核定位情況為以后進一步研究此蛋白的相關功能提供了參考數(shù)