西尼羅病毒免疫診斷方法的建立及對入境人員的血清調查.pdf

1、目的:利用哺乳動物細胞293T細胞表達含有西尼羅病毒(WNV)PrM-E的蛋白，自我組裝成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)，改進優(yōu)化轉染等條件實現(xiàn)大規(guī)模轉染293T細胞，獲得大量的純化蛋白，以此蛋白作為抗原研制檢測西尼羅病毒抗體的ELISA試劑盒，用試劑盒來實現(xiàn)對我國出入境人員的血清進行調查。
　　方法:篩選典型西尼羅病毒株，構建重組質粒，大規(guī)模轉染293T細胞，優(yōu)化轉染的條件和方法，表達西尼羅病毒

2、prM-E蛋白，獲得大量的表達重組蛋白，通過間接免疫熒光實驗驗證表達抗原的完整性和特異性，純化西尼羅病毒prM-E蛋白抗原，ELISA對表達產物進行鑒定制成大規(guī)模的檢測試劑盒;采用蔗糖梯度離心10-60％結合超速離心純化表達產物;將純化的表達產物包被子聚苯乙烯微量反應板，與待檢血清中抗WNV抗體反應后，經(jīng)洗滌，再加入辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG與之結合，然后用TMB作用顯色，建立間接ELISA方法，評價建立的間接ELISA方法對我國入

3、境人員血清進行檢測。
　　結果:重組質粒轉染細胞后產生病毒樣顆粒(viruslike particles VLPs)，優(yōu)化轉染的條件和方法，從轉染的293T細胞從細胞的上清液中和細胞中的表達的蛋白的的純化物中獲得大規(guī)模的重組蛋白，通過間接免疫熒光試驗表明，表達的病毒樣顆粒蛋白具有良好的抗原性;間接ELISA證實，重組蛋白可以作為抗原用于檢測患者血清特異性抗體;純化得到的大量的蛋白包被成ELISA試劑盒，通過對來自西尼羅疫區(qū)的286

4、份我國入境人員血清檢測，與金標準美國FOCUS的WNV IgG檢測試劑盒比較，ELISA-Lab陽性檢出率為35.6％，F(xiàn)OCUSWNVIgG檢測試劑盒則為32.5％，兩者之間無統(tǒng)計學差異(X2=3.05，P=0.078＞0.05),Kappa值為0.8372，兩者具有良好的一致性，其中兩者的陽性檢出符合率為91.18％，陰性符合率為95.34％，總符合率為92.66％。
　　結論:在哺乳動物細胞中表達的西尼羅病毒樣顆粒具有良好的