巨細胞病毒感染在腸神經節(jié)發(fā)育異常中作用機制的初步研究.pdf

1、第一部分人腸神經節(jié)發(fā)育異常與巨細胞病毒感染之間相關性分析
　　目的：探討人腸神經節(jié)發(fā)育異常與巨細胞病毒感染之間的相關性。
　　方法：隨機選取2012年9月-2014年9月間我科的先天性巨結腸及同源病的30例患兒血標本及60份結腸標本（結腸標本包含近端腸神經節(jié)正常段結腸和遠端腸神經節(jié)異常段結腸）作為腸神經節(jié)發(fā)育異常組；選取同時間段的因腸套疊腸壞死接受腸切除腸吻合的10例患兒血標本和10份結腸標本作為對照組。運用ELISA分析兩

2、組患兒血標本CMV-IgG和CMV-IgM陽性率，運用免疫組織化學方法檢測兩組患兒結腸標本中CMV晚期蛋白表達，運用免疫原位雜交技術檢測兩組患兒結腸標本中CMV-DNA，比較兩組患兒結腸CMV感染的差異，同時明確CMV感染結腸的位置。
　　結果：腸神經節(jié)發(fā)育異常組30例血標本中CMV-IgG抗體陽性者8例（26.7％），對照組血標本無陽性病例（P<0.05），CMV-IgM抗體兩組均為陰性；腸神經節(jié)發(fā)育異常組結腸標本共60份，其中

3、CMV晚期蛋白陽性13份（21.7%，其中6份為HD結腸標本，7份為HAD結腸標本，均表達在腸神經節(jié)異常段結腸），對照組結腸標本中均未檢測到CMV晚期蛋白表達(P<0.05)；在腸神經節(jié)發(fā)育異常組中原位雜交技術檢測到的CMV-DNA陽性率與CMV晚期蛋白陽性率重疊，對照組結腸中未檢測到CMV-DNA。CMV-DNA與CMV晚期蛋白的陽性表達的位置不同，CMV晚期蛋白陽性表達主要集中于腸神經節(jié)發(fā)育異常段結腸黏膜層、黏膜下層以及小部分的腸肌

4、層的血管內皮細胞，在近端正常的腸神經節(jié)內無表達，CMV-DNA在近端正常結腸段和遠端異常段結腸的黏膜層、黏膜下層、肌層以及神經節(jié)均呈棕黃色陽性顯色，尤其在腸神經節(jié)細胞中呈強陽性顯色。
　　結論： HCMV感染與腸道神經節(jié)細胞發(fā)育異常密切相關，可能是其發(fā)病的又一重要因素。
　　第二部分先天性 MCMV感染致新生小鼠腸神經節(jié)發(fā)育異常模型的建立
　　目的：建立先天性MCMV感染致新生鼠腸神經節(jié)細胞發(fā)育異常的模型。
　　

5、方法：將無MCMV感染6周齡的Balb/c小鼠按雌雄2:1合籠，根據陰栓判斷孕鼠的受孕時間，選取小鼠胚胎后腸腸神經發(fā)育的起始時間點對孕鼠進行接種MCMV，在孕鼠受孕11d時行腹腔接種1ml不同濃度的MCMV病毒懸液，每種濃度5只孕鼠，觀察不同濃度病毒劑量對孕鼠及胎鼠的影響，確定造模病毒濃度；確定造模病毒濃度后，選取造模所需的病毒濃度1ml，孕11d時接種造模濃度MCMV孕鼠作為模型組，含10只孕鼠，同樣孕齡接種不含MCMV的細胞培養(yǎng)基1

6、ml孕鼠作為對照組，含5只孕鼠，觀察兩組小鼠胚胎的存活率，新生小鼠的體重，同時運用PCR檢測胎鼠結腸CMV-DNA，免疫組化了解新生鼠結腸MCMV蛋白的表達，原位雜交技術檢測新生小鼠結腸CMV特異性核酸序列定位，觀察胎鼠結腸神經嵴干細胞和新生小鼠腸神經節(jié)細胞的變化，來判斷腸神經節(jié)細胞發(fā)育異常模型發(fā)生。
　　結果：1x102PFU/ul濃度接種孕鼠腹腔后胎鼠腸道中檢測不到MCMV，對孕鼠、胎鼠及新生鼠生長發(fā)育無明顯影響；1x104P

7、FU/ul濃度接種孕鼠后，在接種后36h內孕鼠全部死亡；1x103PFU/ul濃度的行孕鼠腹腔內注射后可導致孕鼠的產量降低，同時可造成存活新生小鼠腸道巨細胞病毒感染和腸神經節(jié)細胞發(fā)育異常的發(fā)生，確定造模MCMV濃度為1x103PFU/ul。造模濃度1x103PFU/ul接種的孕鼠為實驗組，與對照組相比，實驗組孕鼠在接種MCMV24小時內出現(xiàn)反應遲緩，食欲下降，活動減少，后逐漸恢復正?；顒樱瑫r觀察實驗組新生小鼠的體重明顯低于對照組（P<

8、0.05），實驗組胎鼠及新生鼠腸管CMV晚期蛋白可檢測到陽性表達，CMV-DNA原位雜交也呈陽性，孕鼠腹腔接種可造成胎鼠的先天性CMV感染；實驗組孕鼠中檢測到新生小鼠發(fā)生腸神經節(jié)發(fā)育異常的比例約14%，腸神經節(jié)發(fā)育異常模型新生小鼠與對照組新生小鼠相比，模型新生鼠腹脹明顯，解剖發(fā)現(xiàn)結腸遠端出現(xiàn)狹窄及近端擴張，病理特征主要表現(xiàn)為結腸遠端腸神經節(jié)細胞數(shù)量減少（P<0.05）。
　　結論：先天性 CMV感染可造成腸神經節(jié)發(fā)育異常模型的發(fā)生

9、，為進一步的CMV感染造成腸神經系統(tǒng)發(fā)育異常的機制研究奠定基礎。
　　第三部分先天性MCMV感染后細胞免疫在腸神經節(jié)發(fā)育異常中作用機制的初步探討
　　目的：初步探討先天性MCMV感染后細胞免疫在小鼠腸神經節(jié)發(fā)育異常中的作用機制。
　　方法：實驗分先天性MCMV感染組和對照組，對兩組胎鼠腸管進行解剖行離體培養(yǎng)，觀察比較兩組腸管的蠕動及存活時間情況，運用流式細胞學技術檢測兩組新生1d小鼠外周血效應性DC和CD8+CTL的差

10、異，Western Blot方法檢測兩組胎鼠結腸組織特異性殺傷作用的細胞因子穿孔素和顆粒酶的表達水平；同時對小鼠胚胎GNCSCs進行分離、培養(yǎng)和鑒定，然后與MCMV共培養(yǎng)，運用Western Blot共培養(yǎng)后48h后GNCSCs的分子MHC-Ⅰ、Fas、TNFR1表達水平變化。
　　結果：與對照組相比，先天性MCMV感染的實驗組胎鼠腸體外培養(yǎng)的蠕動明顯減弱，平均生長時間較正常對照組縮短（P<0.05）,MCMV感染模型組1d小鼠的

11、外周血CD8+CTL和效應DC的比例增高（P<0.05），模型小鼠胚胎結腸組織穿孔素和顆粒酶的表達量明顯上升（P<0.05）；GNCSCs與MCMV共培養(yǎng)后48h，與對照組比較，其形態(tài)及生長并無明顯改變，但其表面分子MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1表達量上調（P<0.05）。
　　結論：先天性CMV感染胚胎后,誘導效應 DC和CD8+CTL增殖，胚胎腸道的GNCSCs的MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1分子表達上調，可促使GNCSCs被