誘導多功能性干細胞-汕頭大學醫(yī)學院醫(yī)學細胞生物學精品課程

1、誘導產(chǎn)生多能性干細胞的研究,里程碑式的科學突破,細胞重編程的研究概況,核移植,核移植試驗最初是在兩棲動物中實現(xiàn)的，通過將體細胞核注入到去核卵母細胞中。迄今，人們已經(jīng)獲得了多種核移植動物，也建立了來源于核移植胚胎的胚胎干細胞系。,體細胞核移植試驗也具有很大的局限性,克隆的效率極低產(chǎn)生的許多后代在各個階段都體現(xiàn)出嚴重的發(fā)育異常由于需要卵母細胞，核移植實驗在人類中的應用受到強烈的倫理學質(zhì)疑這些不足，都制約了核移植技術的進一步發(fā)展和應用

2、。,將成熟的體細胞與多潛能的細胞（ES細胞、胚胎癌細胞等）融合，或者用胚胎干細胞提取物來處理體細胞，也可以在一定程度上使體細胞發(fā)生重編程。,利用這兩種方法，可以實現(xiàn)某些多功能性標志分子的重新表達和多種分化潛能的獲得。但是，體細胞與多能性細胞的融合率較低，融合之后的細胞具有兩套染色體，并且在移植后會發(fā)生排斥現(xiàn)象，這就制約了細胞融合的臨床應用。,有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？,里

3、程碑式的科學突破,2006年11月20日，日本京都大學的山中伸彌（Shinya Yamanaka)和美國威斯康星大學的詹姆斯·湯姆森（James Thomson）分別在《細胞》和《科學》雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細胞改造成了類胚胎干細胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細胞相媲美。,詹姆斯·湯姆森小組的論文發(fā)表在11月20日的《科學》雜志上,俞君英是11月20日《科學》雜志論文的第一作者,200

4、6年8月，日本科學家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功,誘導產(chǎn)生的多功能性干細胞,2006年，Takahashi 和 Yamnaka 將幾個轉(zhuǎn)錄因子導入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞，進而獲得了類似于胚胎干細胞的多能性干細胞，稱之為“誘導產(chǎn)生的多功能性干細胞”（induced pluripotent stem cells,iPS細胞）。這一研究明確地證實了分化的細胞可以通過少數(shù)幾個因子的外源導入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)，因而受到了整個生

5、命科學領域的廣泛關注。,在研究誘導多功能性干細胞產(chǎn)生的原理機制之前，先了解一下體細胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細胞的研究進展,體細胞重編程的過程體細胞重編程的原理體細胞不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細胞的方法,成體細胞核的重編程,1.核重編程：核移植后供體核停止本身的基因表達程序，恢復為胚胎發(fā)育所必需的胚胎化基因表達程序狀態(tài)。此過程包括：染色體結構重建、DNA甲基化、組蛋白乙?；⒂∮浕虮磉_、端粒長度恢復、X染色體失活等。,,1.1.DNA甲基化

6、 1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-42.重塑核結構 主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑,,,3.細胞質(zhì)重編程—miRNA,miRNA是決定細胞分化方向的因子。 細胞中miRNA成分的改變能提高細胞對調(diào)節(jié)基因表達重編程。,,接下來，介紹一下體細胞重編程不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細胞的方法之一：通過特定基因的表達將體細胞重編程過程逆轉(zhuǎn)為干細胞。“基因重新編排技術”，借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細胞中植入

7、一組4個基因 (Oct4,Sox2,c-myc和Klf4 )，通過基因重新編排，使皮膚細胞具備胚胎干細胞的功能。這種被改造過的細胞稱作“iPS細胞”。,,下面簡單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關因子Oct4,Sox2,c-myc和Klf4在多能性調(diào)控中的作用。,1.Oct3/4,Oct-4（也稱Oct-3）屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員[1~3] 。是哺乳動物胚胎發(fā)育的一個關鍵的調(diào)控因子。是全能性的標志，它能夠促使ICM形成、維持

8、胚胎干細胞未分化前狀態(tài)并促進其增殖。,2.SOX2基因,SOX2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因（master genes）家族的一個成員。轉(zhuǎn)錄因子是些與DNA結合并調(diào)節(jié)其他基因表達的蛋白質(zhì),3.癌癥基因c-MYC,癌癥基因c-MYC，是一種最容易過渡表現(xiàn)于人類的致癌基因，它對某些成體干細胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細胞的分化。,4.Klf4,Krueppel-like factor 4，KLF4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子Klf4 (舊稱

9、GKLF)調(diào)節(jié)體外細胞的增生與分化,iPS細胞誘導機制,,已分化的細胞,,導入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4,病毒逆轉(zhuǎn)錄,,胚胎干細胞培養(yǎng)條件和篩選,Ips細胞,誘導多功能細胞,,,,,我們已經(jīng)了解了體細胞重編程的原理和誘導多功能干細胞的產(chǎn)生機制，下面讓我們再深入了解一下Ips細胞的研究概況和Ips細胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)。,Ips細胞的研究概況（研究方法）,這是一種具有很強創(chuàng)新性的研究方法：通過外源導入與多功能

10、相關并且能使重組細胞恢復全能性的轉(zhuǎn)錄基因來誘導體細胞核發(fā)生重新編程，從而使體細胞轉(zhuǎn)變成多能性干細胞。,這種方法所受的啟示來源于“ ES細胞-體細胞融合實驗”。細胞的多能性收到許多因子精密而又復雜的調(diào)控。ES細胞和體細胞融合后能誘導體細胞核的重新編程，ES細胞中存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關重要。,,,Ips細胞的研究概況（兩個相關實驗）,Ips細胞首先由科學家Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。實驗

11、原理如下：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細胞中導入了4個與多功能性有關的基因：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4。利用多能性標志分子Fbx15的表達對轉(zhuǎn)染后的細胞進行了篩選，最終的到了ips細胞，這種細胞的功能和性能幾乎和胚胎干細胞一樣。,另一個實驗的對象是人類皮膚成纖維細胞的重編程，而實驗的過程和上一個實驗基本相同；。只是對所篩選的轉(zhuǎn)錄基因做了一下修飾：去掉了腫瘤相關因子c-Myc，使ips細胞的生產(chǎn)更加安全,Ips細胞系建立的

12、一些重要環(huán)節(jié)（幾種因子的發(fā)現(xiàn)過程）,日本科學家發(fā)現(xiàn)ES細胞中那個存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關重要。科學家對24個與多能性維持相關的候選基因?qū)胄∈蟪衫w維細胞中，依次去掉其中一個基因，最后在得到的10個基因中發(fā)現(xiàn)了4個至關重要的基因，其中任何一個缺失都將導致實驗的失敗，這4個基因中的任意2個或3個組合都無法形成具有ES細胞特性的ips細胞。從而確定了：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4這4種基因,人類ES細胞能

13、夠通過細胞融合實驗室體細胞發(fā)生重編程。美國科學家比較了人類ES細胞和髓前體細胞的基因表達譜，挑選出許多在ES細胞和髓前體細胞的基因表達譜，挑選出許多在ES細胞中相對高表達的基因。再根據(jù)這些基因在多能性調(diào)控中的已知功能對其進行了排序，從中選出14個候選基因。將這些基因以不同的組合方式導入一種由人類ES細胞分化得到的間充質(zhì)樣細胞后，檢驗了不同基因的導入對這種細胞重編程的作用。最后鎖定了4種因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28.,

14、Ips細胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)（Ips細胞的篩選）,Ips細胞的篩選：主要有三種方法：形態(tài)學篩選、藥物篩選和選用對多能性更為關鍵的基因作為報告基因。其中利用Fbx15對ips細胞進行篩選，原理是Fbx25對于多能性的維持和胚胎的發(fā)育來說是不可缺少的基因，所以Fbx25作為篩選ips細胞的報告基因。 僅利用形態(tài)學的標準來代替報告基因的篩選。Maherali等人發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠形態(tài)學篩選可能就足以建立ips細胞系。后來的研究證實了在

15、不對供體細胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態(tài)學篩選的標準對細胞進行篩選也能夠分離出小鼠的ips細胞。利用基因重組技術建立了具有藥物抗性基因的體細胞，這些細胞的抗性受內(nèi)源性Nanog或Oct4表達的調(diào)控。這兩個基因的作用是維持細胞多能性，從而利用這種篩選的方法建立了穩(wěn)定的ips細胞系，這些細胞系在各個方面都表現(xiàn)出了極為相似的特性。,iPS細胞的應用價值和發(fā)展方向,1、利用iPS細胞作為實驗模型，只操縱幾個因子的表達，加速對多能性

16、調(diào)控機理的深入研究。2、獲得的方法相對簡單穩(wěn)定，不涉及胚胎的破壞，無倫理道德限制。3、對于疾病機理研究和新藥開發(fā)等方面將有很大貢獻。4、可望制造特定病人來源的iPS細胞，用“個性化”移植來治療諸多疾病。,誘導性多能干細胞用于治療小鼠帕金森病,美國麻省Whitehead生物醫(yī)學研究的Wernig等近日報告,通過Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子誘導出的iPS細胞可分化成神經(jīng)細胞,可改善帕金森病小鼠的運動功能。,研究

17、者首先檢驗了iPS細胞在體外的分化能力,發(fā)現(xiàn)iPS細胞可以分化成神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,并且能夠進一步生成神經(jīng)元亞型細胞,,,未分化的iPS細胞,iPS細胞在體外分化成神經(jīng)細胞,隨后,研究者用熒光物質(zhì)標記iPS細胞,將其入注射入胚胎小鼠的腦室內(nèi)。9周后(小鼠出生后),研究者發(fā)現(xiàn),iPS細胞可遷移到小鼠腦的各個區(qū)域。,包括腦膜、紋狀體、下丘腦、中腦等部分,并且可分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元,包括谷氨酸性突觸、γ氨基丁酸能神經(jīng)元和兒茶氨酚能

18、神經(jīng)元等亞型,因為這些分化出的細胞具有神經(jīng)細胞的形態(tài),并且表達其特異的標志物,iPS細胞植入小鼠大腦后的分布情況,iPS細胞分化的細胞具有神經(jīng)細胞形態(tài),iPS細胞分化的細胞表達神經(jīng)細胞特異標志物,電生理記錄和形態(tài)學分析表明,iPS細胞分化出的神經(jīng)元細胞植入小鼠體內(nèi)后,具有神經(jīng)元和突觸的形態(tài),參與小鼠的電生理活動，因而可增強受植小鼠大腦的神經(jīng)元活性并參與腦功能。,iPS細胞分化出的神經(jīng)元細胞可發(fā)生膜電位改變,研究者對小鼠大腦一側注射神經(jīng)毒

19、性物質(zhì)6-羥基多巴胺,使該側內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元死亡。這可破壞該側大腦紋狀體,即大腦中負責運動控制的區(qū)域,模擬了帕金森病發(fā)生時的情況。經(jīng)過這樣處理的小鼠運動控制功能受損,因此無法保持平衡而持續(xù)旋轉(zhuǎn)。,接著，研究者對iPS細胞進行特殊處理,確保這些iPS分化成為多巴胺能神經(jīng)元,將其植入小鼠大腦運動功能受損的一側(接受6-羥基多巴胺注射的一側)。幾周后研究者發(fā)現(xiàn),10只受移植的小鼠中有9只的運動功能得到顯著改善，其中甚至有1只小鼠受

20、損側的運動功能好于未受損側。,Ips細胞研究中存在的問題,1、腫瘤相關基因，如c-myc的使用，有誘發(fā)癌癥的可能2、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會導致一些癌基因的激活，也可能導致某些重要基因功能受阻。3、基因表達模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有0.1%。,總結,,組內(nèi)同學的分工,細胞重編程概況部分：演講（陳宇翰），資料（林曉鋒），圖片（梁樂）體細胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細胞以及誘導多功能干細胞誘導機制部分：演講（劉曉暉），資料