反轉錄

1、反轉錄反轉錄簡單點說就是從RNA生成CDNA的過程。所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基這些活性包括依賴于RNA的DNA合成依賴于DNA的DNA合成以及對D

2、NA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于23kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值最適鹽濃度和最適溫室各不相同所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都

3、必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3端poly(A)結合的1218核苷酸長的oligo(dT)。cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:(1)自身引導法合成的單鏈cDNA3端能夠形成一短的發(fā)夾結構這就為第二鏈的合成提供了現成的引物當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈最后用對單鏈特異性的

4、S1核酸酶消化該環(huán)即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA5端序列出現缺失和重排因而該方法目前很少使用。(2)置換合成法該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性而是在dNTP存在下利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物使之成為合成第二鏈的引物在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優(yōu)

5、點:(1)非常有效(2)直接利用第一鏈反應產物無須進一步處理和純化(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。目前合成cDNA常采用該方法。反轉錄反轉錄簡單點說就是從RNA生成CDNA的過程。所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分

6、離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基這些活性包括依賴于RNA的DNA合成依賴于DNA的DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性但降解RNADNA雜交體中的RNA的能力較弱且對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于23kb)。AMV反轉錄酶和

7、MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值最適鹽濃度和最適溫室各不相同所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3端poly(A)結合的1218核苷酸長的oligo(dT)。cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:(1)自身引導法合成的單鏈cDNA3端能夠形成一短的發(fā)夾結構這就為第二鏈的合成

8、提供了現成的引物當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán)即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA5端序列出現缺失和重排因而該方法目前很少使用。(2)置換合成法該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性而是在dNTP存在下利用RN