內切型-β-葡聚糖酶基因的克隆與表達.pdf

1、內切型-β-葡聚糖酶(endo-β-glucanase，EG)是纖維素酶的重要組分之一，在纖維素水解、棉織物生物整理、飼料、造紙等領域中應用廣泛。本文對內切型-β-葡聚糖酶基因的克隆及其在原核細胞、畢赤酵母和絲狀真菌中的表達進行了系統(tǒng)研究。
　　將厭氧真菌內切型-β-葡聚糖酶的基因celE與表達載體pET-28a(+)重組后，轉入大腸桿菌BL21(DE3)。采用SDS-PAGE蛋白電泳對重組大腸桿菌表達產物進行分析，在42 kDa

2、附近得到了與目的蛋白催化區(qū)域理論值相當的蛋白條帶。酶學性質研究表明，酶蛋白的最適作用條件為pH6.0，45℃。搖瓶條件下重組大腸桿菌的EG活力可達到39.1 IU ml-1。
　　將celE基因與含有乙醇氧化酶啟動子(AOX1)的表達載體pPIC9K重組，采用基因導入儀將線性化后的重組DNA導入畢赤酵母GS115，篩選得到3株高G418抗性的轉化子。經PCR鑒定表明:celE基因已整合到畢赤酵母的基因組上，這一特點有利于保持遺傳性

3、狀的穩(wěn)定。在搖瓶培養(yǎng)條件下，以1.0％的甲醇為碳源和誘導物，96h發(fā)酵液中EG活力可達74.1 IU ml-1。
　　以根瘤農桿菌AGL-1為介導，對里氏木霉(Trichoderma reesei) ZU-02分生孢子體系的DNA轉化技術進行了研究。構建了含里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅰ強啟動子Pcel7a（及其信號肽）和終止子Tcel7a以及潮霉素B抗性標記的新型重組質粒pCB-hPsT，該質粒適用于將目的基因導入里氏木霉中并實現(xiàn)分泌

4、表達，為外源基因在絲狀真菌中的克隆與高效表達提供了一個新的技術平臺。對農桿菌介導的轉化條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)孢子的預萌發(fā)處理對轉化效率的提高有重要作用，當萌發(fā)時間從0h提升到3h，轉化效率可提高25倍以上。該研究結果對于進一步完善絲狀真菌基因導入技術平臺具有重要意義。
　　采用生物信息學技術分析了厭氧真菌基因和里氏木霉基因之間的序列差異，依據里氏木霉的密碼子偏好對celE序列的催化區(qū)域進行了優(yōu)化，得到新基因序列celEn。采用pCB

5、-hPsT農桿菌介導載體，分別構建含有原始催化區(qū)域celE*和優(yōu)化催化區(qū)域celEn的重組質粒pCB-hE*和pCB-hEn。采用農桿菌介導技術將目的基因導入到里氏木霉中，分別獲得了300株重組菌株T.reesei/pCB-hE*和293株重組菌株T.reesei/pCB-hEn，后者在以CMC為唯一碳源的平板上生長明顯加快，并篩選到8株高產CelEn的重組里氏木霉T.reesei/pCB-hEn。在搖瓶條件下發(fā)酵84h時EG活力最高可

6、達193.6 IU ml-1(pH6.0)，約是出發(fā)菌株同期EG酶活的6.0倍。該研究成功實現(xiàn)了厭氧真菌的內切型-β-葡聚糖酶基因在好氧真菌里氏木霉中的分泌表達，所獲得的纖維素酶在牛仔織物水洗整理中具有重要的應用價值，該項研究成果填補了國內中性纖維素酶的生產空白。
　　采用pCB-hPsT農桿菌介導載體，將里氏木霉的內切型-β-葡聚糖酶基因cel5a置于強啟動子Pcel7a和終止子Tcel7a之間，進一步導入并整合到T.reese