重組人胰高血糖素樣肽-2二串體的制備及活性研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是胰高血糖素原基因(proglucagon,PG)衍生肽類(PGDP)之一,是一種腸道特異性營養(yǎng)因子,由33個氨基酸殘基構成,序列為HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,分子量約為3.9kDa[1]。GLP-2在腸道的生物學活性包括:促進小腸和大腸粘膜生長、抑制腸和隱窩細胞凋亡、促進腸內葡萄糖運輸和GLUT-2表達、增加營養(yǎng)吸收、

2、抑制胃排空和胃酸分泌、降低腸通透性、增高腸血流量等[2]。鑒于其上述生物學活性,它被開發(fā)用于短腸綜合征、炎癥性腸病和腸型放射病等疾病的治療。此外,值得注意的是,GLP-2極易被二肽激酶IV(DPPIV)在其氮末端第二位的丙氨酸水解而失去活性,其在體內的半衰期僅為7min[3]。而如果用甘氨酸將丙氨酸替換,就可以抵抗DPPIV的水解而增長半衰期[4]。
　　雖然GLP-2有廣泛的應用前景,但大量的文獻報道顯示,目前應用于臨床和實驗的

3、GLP-2及其類似物大多通過化學合成方法獲得,而這種方法不但技術復雜、周期較長,而且成本較高[5]。此外,因為其分子量較小,通過基因工程使其在大腸桿菌中直接表達來大規(guī)模的生產(chǎn)也不太可能。這都大大限制了它在臨床和實驗研究中的廣泛應用。如何快速、經(jīng)濟的獲取具有活性的GLP-2或其類似物正是本課題將要解決的問題。
　　本課題在優(yōu)化GLP-2結構的基礎上將其基因進行串聯(lián)設計并合成,然后將其亞克隆到pET-22b載體,成功構建了人GLP-2

4、二串體基因重組表達載體pET-22b(+)-GLP-2②,并將pET-22b(+)-GLP-2②轉化到表達宿主菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導后能高水平表達目的蛋白GLP-2②,經(jīng)過硫酸銨鹽析粗提純和陰離子交換柱層析精細提純獲得了高純度的重組蛋白GLP-2②,經(jīng)Tricine-SDS-PAGE、免疫印跡(Westernblot)和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)鑒定其為目的蛋白。通過體外GLP-2②對Ca