植物(豆芽)吡哆胺—吡哆醛轉(zhuǎn)換反應(yīng)作用酶的分離純化及表征.pdf

1、維生素B6(VB6)是一類(lèi)吡啶化合物的總稱(chēng),游離型為吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxine,PM)和吡哆醛(Pyridoxal,PL),三者相應(yīng)磷酸酯形式為磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)。其中PLP是VB6的主要輔酶形式,參加催化涉及氨

2、基酸的各種代謝反應(yīng),在其他多種物質(zhì)的合成和代謝過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。
　　PM-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(Pyridoxamine-Pyruvate aminotransferase,PPAT)催化PM和PL之間的相互轉(zhuǎn)化,它以PM和丙酮酸為底物生成PL和L-丙氨酸,同時(shí)谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)在脫掉PLP輔基的條件下也可以催化PM和PL的相互轉(zhuǎn)化,這些分別在微生物和動(dòng)物中被發(fā)

3、現(xiàn)證實(shí),植物體內(nèi)也存在PM和PL的相互轉(zhuǎn)化,但作用酶及其酶的性質(zhì)還不明確。
　　本論文首先對(duì)豆芽中的GOT進(jìn)行分離純化,粗酶液經(jīng)過(guò)兩次硫酸銨分段沉淀、兩次Sephadex G-100凝膠過(guò)濾柱層析、兩次DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析等分離純化技術(shù),GOT被純化了200.8倍,通過(guò)對(duì)純化酶的底物特異性分析,發(fā)現(xiàn)GOT全酶并不能催化PM和丙酮酸反應(yīng)生成PL和丙氨酸,只有在脫P(yáng)LP輔基(pH2.7)的條

4、件下,才能催化PM和草酰乙酸反應(yīng)生成PL。
　　對(duì)豆芽中的GOT進(jìn)行純化分析后,再對(duì)豆芽中的PPAT進(jìn)行分離純化,通過(guò)兩次硫酸銨分段沉淀、兩次Sephadex G-100凝膠過(guò)濾柱層析、兩次DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析等分離純化技術(shù),對(duì)新鮮豆芽中的吡哆胺-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分離純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),樣品呈現(xiàn)單一條帶。研究結(jié)果表明:該酶被純化了207.56倍,得率為7.84％;通過(guò)底物特