TiM-3在肝癌細胞轉(zhuǎn)移中作用機制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular cancer，HCC)是人類發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的生理過程，EMT參與了許多生理和病理過程，并且發(fā)揮了重要作用，EMT的發(fā)生機制在眾多實體腫瘤中進行了深入的研究，包括肝癌。然而肝癌治療需要對EMT發(fā)生的調(diào)控機制進行深入的研究。
　　T細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3(Tim-3)是TIM基因家族的重要成員之一，被認為參與了多種類型癌的進展，包括肝細胞癌

2、(HCC);在肝癌的進展中，Tim-3被認為是一種新的參與者，并且調(diào)節(jié)著肝癌的生物學(xué)行為。
　　本文旨在探討Tim-3在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機制和Tim-3與肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。
　　第一部分 Tim-3在肝癌細胞中低表達和過表達細胞模型的建立
　　目的:
　　探討Tim-3在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用，檢測Tim-3在肝癌細胞及正常肝細胞的表達情況，構(gòu)建Tim-3高表達及低表達細胞模型，并檢驗?zāi)Ｐ褪欠窠⒊晒Α?/p>

3、
　　方法:
　　1、培養(yǎng)人類肝癌細胞SMMC-7721、正常人肝細胞LO2。
　　2、熒光實時定量PCR(Real-time fluorescent polymerase chainreaction, Real-time PCR)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測肝癌細胞SMMC-7721、正常人肝細胞LO2中Tim-3 mRNA和蛋白的表達。
　　3、通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法將PEX-3-hTim-

4、3過表達質(zhì)粒及Tim-3siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細胞SMMC-7721，轉(zhuǎn)染成功后建立了肝癌細胞Tim-3的高表達和低表達細胞模型。
　　4、轉(zhuǎn)染后24小時，通過倒置熒光顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染成功的肝癌細胞表達GFP，鏡下可顯示綠色熒光。運用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件，進行圖像采集、分析。同時轉(zhuǎn)24小時后通過Real-time PCR檢測Tim-3 mRNA表達;72小時通過Western blot檢測Tim-3蛋白表達來

5、鑒定模型。
　　結(jié)果:
　　1、與正常人肝細胞LO2相比肝癌細胞MMC-7721高表達Tim-3，提示Tim-3可能與肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　2、熒光顯微鏡觀察兩組轉(zhuǎn)染細胞，兩組細胞均可見綠色熒光，統(tǒng)計分析轉(zhuǎn)染siRNA和過表達質(zhì)粒PEX-3-hTim-3轉(zhuǎn)染效率分別為81.25％和83.36％。
　　3、RT-PCR和Western blot結(jié)果提示轉(zhuǎn)染PEX-3-hTim-3高表達質(zhì)粒的肝癌細胞組，Tim

6、-3的表達明顯高于對照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEX-3組。轉(zhuǎn)染Tim-3 siRNA，Tim-3的表達較對照組和轉(zhuǎn)染siRNA-NC組明顯減低。
　　結(jié)論:
　　Tim-3在肝癌細胞和正常肝細胞均有表達，肝癌細胞MMC-7721 Tim-3的表達高于正常人肝細胞LO2，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義;通過轉(zhuǎn)染成功建立肝癌細胞高表達Tim-3和低表達Tim-3細胞模型。
　　第二部分 Tim-3對肝癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響及其機制

7、的研究
　　目的:應(yīng)用建立的高表達和低表達Tim-3肝癌細胞模型研究Tim-3對肝癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響，探討Tim-3影響肝癌轉(zhuǎn)移侵襲性的可能機制。
　　方法:1、實驗分三組:對照組:未接受轉(zhuǎn)染的肝癌細胞SMMC-7721;實驗組:轉(zhuǎn)染Tim-3 siRNA，低表達Tim-3的肝癌細胞;陽性對照組:轉(zhuǎn)染PEX-3-hTim-3過表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后癌細胞高表達Tim-3。2、三組肝癌細胞培養(yǎng)72小時后，在倒置熒光顯微鏡下觀察

8、三組細胞鏡下特點。3、通過MTT法檢測三組肝癌細胞增殖能力變化。
　　4.Transwell小室侵襲實驗、細胞劃痕損傷愈合實驗檢驗三組肝癌細胞遷移和侵襲能力。揭示Tim-3對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。5、RT-PCR檢測不同分組肝癌細胞Tim-3及EMT相關(guān)基因:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Slug、Snail、Smad，mRNA的表達，同時通過Western blot檢測E-cadh

9、erin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Slug、Snail、Smad蛋白表達，每個實驗重復(fù)三次。6、分析Tim-3表達與EMT相關(guān)基因表達的相關(guān)性。7、統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)以平均數(shù)標準差表示，并用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。
　　結(jié)果:1、SMMC-7721細胞轉(zhuǎn)染72小時后，通過倒置熒光顯微鏡對三組的細胞形態(tài)觀察，與實驗組相比較，陽性對照組細胞形態(tài)多發(fā)為紡錘形態(tài)，細胞之間

10、形態(tài)和連接較少，表現(xiàn)為更強的遷移和侵襲性，同時實驗組上皮細胞多觸角凸起，表現(xiàn)為更強的緊密接觸和粘附性，表現(xiàn)出低的遷移和侵襲性。
　　2、MTT檢測三組肝癌細胞細胞增值率，在前12小時細胞增值率沒有顯著差異，12小時后三組細胞增值率出現(xiàn)顯著差異，在觀察的72小時內(nèi)，隨著時間延長，差異越來越明顯。培養(yǎng)72小時，實驗組與對照組相比較，肝癌細胞增殖能力明顯下降，實驗組增殖能力是對照組的71.71％(F=145.758，P＜0.05)陽性對

11、照組細胞增殖能力明顯高于對照組和實驗組，是對照組的260.12％，有顯著性差異(F=195.428，P＜0.05)。
　　3.Transwell遷移實驗中:實驗組與對照組和陽性對照組相比較，肝癌細胞遷移和侵襲明顯減少，設(shè)置對照組遷移和侵襲的細胞數(shù)為100;實驗組遷移和侵襲的相對細胞數(shù)分別為:61±8和34±7;陽性對照組遷移和侵襲的相對細胞數(shù)細胞數(shù)分別為:157±10和179±11三組之間比較均有顯著性差異(P＜0.05)，實驗說

12、明抑制Tim-3表達肝癌細胞遷移和侵襲力明顯下降。故Tim-3表達水平的改變，影響肝癌的遷移和侵襲性。細胞劃痕實驗72小時后三組細胞均向劃痕中間遷移，陽性對照組肝癌細胞幾乎將中間劃痕鋪滿，對照組劃痕部位仍有一定間隙，實驗組肝癌細胞少量向劃痕中間遷移，實驗組傷口愈合率較陽性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=168.365，P＜0.05）。
　　4、RT-PCR結(jié)果顯示，陽性對照組E-cadherin的表達較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

13、(F=2830，P＜0.05)，而N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達量較對照組明顯升高，差異均有有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組降低了Tim-3的表達，E-cadherin的表達較對照組明顯上升，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(F=2932,P＜0.05)，同時N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達量較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

14、（P＜0.05），Western blot實驗結(jié)果同PCR結(jié)果一致，同樣表明抑制Tim-3表達，可阻止肝癌EMT的發(fā)生。
　　5、Tim-3的表達與E-cadherin的表達成負相關(guān)(r=-0.870，P=0.00＜0.05),Tim-3表達與N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad均呈現(xiàn)正相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　結(jié)論:1、三組細胞培養(yǎng)72小時鏡下觀察細胞形態(tài)，實驗組細

15、胞上皮細胞多觸角凸起，表現(xiàn)為更強的緊密接觸和粘附性呈現(xiàn)出低侵襲和轉(zhuǎn)移性。陽性對照組細胞為紡錘形態(tài)，細胞之間形態(tài)和連接較少，表現(xiàn)為更強的遷移和侵襲性。陽性對照中肝癌細胞獲得EMT的特點。
　　2、通過MTT法檢測三組細胞的增殖率，陽性對照組在細胞培養(yǎng)12小時后，細胞增殖率高于實驗組和對照組，提示Tim-3表達可能影響肝癌細胞的增殖。
　　3、Transwell小室遷移實驗和細胞劃痕實驗檢驗三組細胞的遷移及侵襲性，結(jié)果提示高表達

16、Tim-3的陽性對照組細胞表現(xiàn)較強的遷移及侵襲性，而實驗組抑制Tim-3的表達，細胞的遷移及侵襲性明顯降低，兩組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，提示Tim-3促進了肝癌細胞的遷移及侵襲。
　　4、Real-time PCR和Western bolt檢測EMT相關(guān)標志物:E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達。結(jié)果提示:陽性對照組中上皮標記物E-cadherin的表達

17、下降，而間質(zhì)標記物:N-cadherin、MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達上升，從而提示肝癌細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;實驗組抑制Tim-3的表達，E-cadherin的表達明顯上升，而間質(zhì)標記物:N-cadherin、 MMP-9、Twist1、Snail、Slug、Smad的表達下降，肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制，提示Tim-3促進肝癌細胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致遷移和侵襲能力增大，這與MTT實驗、細胞劃痕實驗、