CD11b與CD27定義的人類NK細胞亞群在HIV疾病進展中的變化及相關機制的研究.pdf

1、目的：NK細胞是固有免疫的重要組成部分，無需抗原預先致敏，即可直接殺傷腫瘤、病毒或細菌感染的靶細胞，是機體免疫防御的第一道防線，在機體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。HIV感染是目前全世界未能攻克的難題，越來越多的研究證明，NK細胞的先天免疫反應在抵抗HIV感染中發(fā)揮著重要的作用。NK細胞是一群異質(zhì)性的細胞，由于CD56的發(fā)現(xiàn)將人類NK細胞重新劃分了不同亞群，然而CD56抗原不表達在嚙齒動物，且以CD56為標志的NK細胞分群

2、不能更好地對NK細胞進行功能性分群，因此研究者們不斷的探索NK細胞新的分群方法，以便于發(fā)現(xiàn)更好的功能性分群標志物。在2011年首次報道了應用CD11b和CD27定義人類NK細胞不同亞群和功能特異性。根據(jù)CD11b和CD27定義了人類NK細胞4個亞群，分別為CD11b-CD27+(CD27+SP)，CD11b+CD27+(DP)，CD11b-CD27-(DN)，CD11b+CD27-(CD11b+SP)，可以反映了人類NK細胞不同的亞群和

3、功能特異性。研究報道CD11b與CD27定義的NK細胞亞群在肺癌患者中發(fā)生明顯的變化，并且與肺癌疾病進展有關，提供了腫瘤逃脫NK細胞調(diào)節(jié)腫瘤免疫的一個新的機制。那么，作為HIV感染過程中最先參與抗病毒反應的NK細胞，是否NK細胞功能的紊亂與四個亞群的改變有關？以及亞群的變化與HIV疾病進展是否有關？相關機制如何？國內(nèi)外未報道，值得我們?nèi)ド钊胙芯亢吞剿?。本研究為了探究在HIV感染過程中NK細胞的功能紊亂是否與CD27與CD11b定義的亞群

4、改變有關，以及各亞群的變化與HIV疾病進展的關系和發(fā)生的機制。為更好的防治HIV病毒感染以及研究HIV發(fā)生發(fā)展機制奠定重要基礎，同時為HIV病毒逃脫NK細胞調(diào)節(jié)的抗病毒免疫提供一個新的機制。
　　方法：選取中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診的HIV感染者，包括新發(fā)感染者、慢性感染者、HARRT治療者，以及正常對照者。實驗方法包括：CD4+T細胞絕對值檢測將CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，逆向

5、加樣法加入抗凝全血，加入1×免洗溶血素，應用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，MultiSET軟件分析結果；HIV病毒載量測定取EDTA抗凝血漿，采用Roche公司COBAS(@) AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@) System自動載量儀上以實時熒光定量PCR方法測定病毒載量；NK細胞、CD4+T細胞表面受配體的檢測采用全血染色，加入相應的熒光抗體及同型對照等進行避光染色。加入溶血素，1％多聚甲醛F

6、ACS LSRⅡ流式細胞儀上機檢測；CD27與CD11b定義的NK細胞亞群分泌IFN-γ的情況提取HIV感染者PBMC，于96孔板中加入刺激物，在收細胞前6h加入Golgistop，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收細胞，加入熒光抗體表面染色，離心洗滌后破膜胞內(nèi)IFN-γ遮光染色，1％多聚甲醛上機檢測；血清中可溶性ICAM-1的檢測采用ELISA方法檢測正常人和HIV感染者血清中可溶性ICAM-1，按照說明書操作步驟進行操作；TGF-β對CD11b

7、與CD27定義的NK細胞亞群表達量的影響提取正常人PBMC，與TGF-β共培養(yǎng)。加入熒光抗體，1％多聚甲醛固定上機檢測；含高濃度可溶性ICAM-1的HIV感染者血漿對CD27與CD11b定義的NK細胞亞群的影響提取正常人PBMC，加入含有高濃度可溶性ICAM-1的HIV感染者血清，培養(yǎng)48h。熒光單克隆抗體染色，離心洗滌，加入1％多聚甲醛上機檢測；統(tǒng)計學分析應用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計分析，比較組間差異采用參數(shù)檢驗或者非參數(shù)檢驗。

8、相關性分析采用Spearman秩相關檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：⑴HIV感染者CD11b與CD27定義的NK細胞亞群發(fā)生明顯的變化且與疾病進展有關。HIV慢性感染者表達的CD11b顯著降低，經(jīng)治療后有所恢復但仍低于正常人(P＜0.001)。HIV感染者NK細胞未成熟DN亞群在慢性感染者中明顯增多，經(jīng)HARRT治療后，雖有所恢復但仍顯著高于正常入水平(P＜0.001)。殺傷功能亞群CD11b+SP在慢性感染者顯著降

9、低，經(jīng)治療后有所恢復但仍低于正常人水平(P＜0.001)。HIV感染者中未成熟DN亞群與CD4+T細胞絕對數(shù)成負相關(r=-0.320，P=0.012)，殺傷功能亞群CD11b+SP與CD4+T細胞絕對數(shù)成正相關(r=0.375，P=0.003)。HIV慢性感染者CD27+SP亞群與病毒載量成顯著的正相關(r=0.548，P=0.015)。CD27+SP亞群和DN亞群在HIV感染者中不論疾病進展好還是不好均高于正常人，但疾病進展不好的人

10、群表達的較疾病進展好的人群高。CD11b+SP正常人顯著高于HIV感染者，但疾病進展好的HIV感染者高于疾病進展不好的人群。⑵HIV感染者CD11b與CD27定義的NK細胞亞群功能研究。CD27+SP、DP、CD11b+SP亞群分泌IFN-γ的功能明顯高于DN亞群。⑶傳統(tǒng)NK細胞亞群與CD11b和CD27定義NK細胞亞群的區(qū)別與聯(lián)系。與CD27和CD11b定義的NK細胞亞群相比，傳統(tǒng)的NK細胞亞群與HIV疾病進展關系并不顯著。在CD56

11、bright亞群中主要表達DP和CD11b+SP亞群，在CD56dim亞群中主要表達CD11b+SP亞群。DN亞群與CD56bright亞群呈負相關，CD27+SP亞群和DP亞群與CD56dim呈顯著負相關，CD11b+SP與CD56dim呈顯著正相關。⑷HIV感染者CD11b與CD27定義的NK細胞亞群變化的相關機制研究。將TGF-β與PBMC共培養(yǎng)，實驗結果顯示，TGF-β能明顯促進未成熟DN亞群增多，且具有統(tǒng)計學意義(P=0.04

12、5)。HIV感染者CD4+T細胞上膜性ICAM-1與正常人相比無明顯的變化，而HIV感染者血清中sICAM-1表達水平增高(P＜0.001)，HARRT治療后雖然有所降低但仍高于正常入水平(P=0.004)。將含有高濃度sICAM-1的HIV感染者血清與正常人PBMC共培養(yǎng)，結果顯示，加入含有高濃度sICAM-1的HIV感染者血清的實驗組較對照組未成熟DN亞群明顯增高而殺傷功能亞群CD11b+SP明顯降低。
　　結論：①與正常入相