SP600125對大鼠BMSCs在TNF-α作用下的抗凋亡及軟骨分化能力的影響研究.pdf

1、目的:關節(jié)軟骨是運動系統(tǒng)的重要組成部分，人口老齡化引起的關節(jié)軟骨磨損、退行性變和各種創(chuàng)傷及運動損傷造成的軟骨損傷逐漸增多。關節(jié)軟骨屬于透明軟骨，軟骨細胞和細胞外基質(extracellular matrix， ECM)是其主要組成部分，其為一種形式特別的結締組織。關節(jié)軟骨的功能主要包括兩個方面，一是減輕關節(jié)運動過程中作用于軟骨下骨的壓力，二是減少關節(jié)面的摩擦。因為軟骨組織的營養(yǎng)只是來源于關節(jié)液，同時也沒有血液供應，所以，在軟骨組織發(fā)生破

2、壞以后，血液或骨髓里的祖細胞無法被激活進入缺損處進行修復，損傷很難自愈。如果沒有得到正確的處理，那么骨性關節(jié)炎的發(fā)生是在所難免的。骨性關節(jié)炎是一種慢性退行性疾病，主要在髖關節(jié)、膝關節(jié)等負重關節(jié)多發(fā)。它在病理上的改變主要體現(xiàn)在:軟骨的骨化退變、關節(jié)內游離體的形成、繼發(fā)性的軟骨下骨囊性變、關節(jié)邊緣骨贅形成、以及骨重塑增多等方面。它以引起關節(jié)的退行性變及受累關節(jié)的疼痛為特點，目前還沒有徹底阻止其進展的方法。骨性關節(jié)炎發(fā)展的主要因素為關節(jié)組織內

3、的慢性炎癥以及其漸進性的結構改變。TNF-α，作為一個重要的在骨性關節(jié)炎中高表達的細胞因子，它可以通過ERK，p38，JNK，AP-1和NF-κB的轉錄增加MMP-13的表達。傳統(tǒng)的軟骨修復方法都不能夠逆轉骨性關節(jié)炎的病程進展，最終會采取人工關節(jié)置換的方法來達到緩解癥狀和恢復功能的目的。
　　炎癥的分類主要包括細菌性和無菌性兩大類。在類風濕性關節(jié)炎、老化或者雌激素缺乏等病人的血液中，炎癥因子TNF-α的表達量均有不同程度的升高。有

4、些外來物如細菌毒素(如LPS)和細胞碎片等都可以刺激機體產生很多炎癥細胞因子（如TNF-α等)，進而NF-κB等炎癥反應相關的轉錄因子被誘導激活，使得機體發(fā)生一系列的炎癥反應。在骨性關節(jié)炎的過程巾，由滑膜分泌的炎性因子對軟骨細胞的影響主要體現(xiàn)在對軟骨細胞基質的降解上。有體外研究表明，IL-1β和TNF-α能夠明顯抑制BMSCs的成骨及成軟骨分化作用。除此之外，TNF-α還能直接引起大鼠BMSCs的凋亡。
　　JNK信號通路可以參與

5、機體的各種生物學反應，主要包括細胞形態(tài)維持和細胞骨架構建，同時還有細胞凋亡、細胞惡變以及細胞增殖與分化等。其中缺血/再灌注損傷的主要機制之一就是JNK參與的細胞凋亡作用。JNK信號通路可被表皮生長因子、細胞因子(TNF-α、IL-1)、應激及G蛋白偶聯(lián)受體等胞外刺激激活。已有研究表明，IL-1可以通過JNK信號通路誘發(fā)透明軟骨組織中的蛋白多聚糖降解。HebaM等人進一步在小鼠骨性關節(jié)炎模型研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1兩種細胞因子都可

6、以激活JNK-2基因進而使得軟骨組織中的蛋白多聚糖降解。本研究主要是通過對JNK信號通路的抑制，來改造大鼠的BMSCs，進而探究通過此種方法改造后的BMSCs，在炎癥細胞因子TNF-α的作用下的抗凋亡能力及其向軟骨分化能力是否有所提高。
　　研究方法:1、BMSCs細胞培養(yǎng)、誘導分化及相關鑒定:常規(guī)對BMSCs進行培養(yǎng)，視細胞生長情況進行胰蛋白酶消化、傳代，鋪板后對細胞進行成脂、成骨、成軟骨誘導分化，對成脂分化細胞進行油紅染色，對

7、成骨分化細胞進行茜素紅染色，對成軟骨分化細胞進行阿利新藍染色。2、Western blot檢測各組細胞的p-JNK蛋白表達:經(jīng)SP600125處理后，利用Western blot檢測各組細胞p-JNK蛋白表達的情況。3、MTT細胞活性檢測:將BMSCs接種于96孔培養(yǎng)板中，用不同的藥物處理細胞后，以MTT法通過OD值反映細胞活性。4、對凋亡細胞的形態(tài)進行觀察:取對數(shù)增長期的BMSCs鋪于6孔板培養(yǎng)24 h，之后在各孔內加入不同藥物反應，

8、其中陰性對照組不加藥物，其余各組加入50 ng/ml的TNF-α，在5％ CO2，37℃恒溫箱反應24 h，其中實驗組的細胞用10μM的SP600125預先處理1h。之后將6孔板置于倒置顯微鏡下觀察不同處理組之間BMSCs的形態(tài)學變化。5、TUNEL及DAPI細胞核染色:利用TUNEL/DAPI對細胞核染色，熒光顯微鏡下對細胞核形態(tài)進行觀察。從細胞核形態(tài)及顏色兩方面反映細胞凋亡情況。正常細胞核無綠色熒光，呈常規(guī)橢圓狀;凋亡細胞核會呈現(xiàn)出

9、綠色熒光，同時細胞核形態(tài)也發(fā)生變化，表現(xiàn)出核固縮成團，甚至碎裂溶解。6、通過流式細胞術對細胞凋亡進行測定:利用AnexinⅤ/PI雙染法檢測處理后細胞早期及晚期凋亡情況。7、Western blot檢測細胞凋亡蛋白的表達:利用Western blot檢測處理后，細胞P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspass9、cleavedcaspass3等凋亡相關蛋白表達情況。8、Transwell細胞遷移實驗:處理后的細胞，用Tra

10、nswell細胞遷移試驗，對細胞的遷移能力進行觀察。9、成軟骨分化過程中MTT細胞活性檢測:取成軟骨分化后1天、7天、14天的細胞進行MTT細胞活性檢測，通過490 nm處的吸光度值來反映不同時間點的細胞的活性變化。10、實時定量PCR對成軟骨分化相關基因的表達進行檢測:細胞成軟骨分化14天后，提取mRNA，反轉錄成cDNA后采用實時定量PCR的方法對成軟骨相關基因Agc、Sox9進行檢測。11、成軟骨分化后細胞阿利新藍染色:于6孔板中

11、對BMSCs進行成軟骨分化14天后，PBS洗3次，4％的多聚甲醛固定，PBS洗3次，用阿利新藍染液染色后，于倒置顯微鏡下觀察不同處理組之間BMSCs的染色情況。12、3D培養(yǎng)法誘導細胞成軟骨分化:細胞計數(shù)后置于15 ml離心管中，500×g離心5 min，于5％ CO2，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，待細胞成團后，用含有不同藥物的成軟骨分化培養(yǎng)基進行誘導分化。13、軟骨球冰凍切片后阿利新藍染色:3D培養(yǎng)法誘導不同組的細胞成軟骨分化后，細胞固

12、定，OCT包埋，軟骨球進行冰凍切片后進行阿利新藍染色，顯微鏡下觀察照相。14、軟骨分化后細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色:取固定透化的細胞標本，加入兔抗鼠Ⅱ型膠原抗體（一抗）稀釋液置于4℃冰箱過夜。將標本從冰箱中取出，PBS洗3次，加入FITC標記的山羊抗兔IgG1∶200稀釋，置于37℃溫箱中60分鐘，80％甘油PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察。15、Western blot檢測成軟骨分化蛋白的表達:利用Western blot檢測成軟骨分化后

13、，細胞Agc、Col2a1成軟骨分化相關蛋白及MMP-1、MMP-3、MMP-13等炎癥相關蛋白表達情況。
　　結果:1、BMSCs體外貼壁生長良好，具有成脂、成骨、成軟骨分化潛能。BMSCs細胞貼壁生長，呈長棱形，漩渦狀生長，分布均勻。加入特定的誘導分化培養(yǎng)基后出現(xiàn)相應的形態(tài)學變化:成脂分化的細胞內脂滴可以被油紅O染成紅色，成骨分化后產生的鈣結節(jié)可以被茜素紅染成紅色，成軟骨分化后的細胞被阿利新藍染成藍色。2、SP600125能夠

14、有效抑制TNF-α所引起的p-JNK蛋白高表達。Western blot檢測所示，相對于陰性對照組TNF-α可以引起p-JNK蛋白的表達增高，在應用了SP600125預處理后，相對于單獨應用TNF-α處理組，p-JNK蛋白的表達有所減低。3、SP600125可以增強TNF-α處理后細胞的活性。相對于單獨有TNF-α處理組，用SP600125預處理的細胞活性有不同程度的增強，其中以濃度為10μM組，效果最為明顯。4、TNF-α處理后細胞出

15、現(xiàn)了凋亡形態(tài)學變化，應用SP600125后凋亡程度有所減輕。TNF-α處理后部分細胞固縮，失去原有的纖維樣形態(tài)，變圓，細胞排列不緊密，貼壁能力下降。在應用SP600125后上述形態(tài)細胞有所減少。5、TUNEL/DAPI細胞核染色分析細胞凋亡。TUNEL/DAPI核染色之后于熒光顯微鏡下對細胞核進行觀察。對照組細胞核呈現(xiàn)為正常一致的橢圓形，均勻的藍色熒光，無綠色熒光。TNF-α處理組細胞核呈現(xiàn)為固縮、碎裂、片狀，失去正常核形態(tài)，呈綠色熒光

16、。在用SP600125預處理細胞后，細胞核凋亡情況有了明顯改善。6、AnnexinⅤ/PI雙染法證實SP600125可以增強BMSCs的抗凋亡能力。TNF-α處理組的細胞凋亡率明顯高于對照組，但在應用SP600125預處理后，細胞凋亡率有所下降。7、SP600125預處理后細胞的凋亡蛋白表達量相對于單獨應用TNF-α處理組有明顯減低。Western blot結果顯示，在應用TNF-α處理后Clevead-caspase-9和Clevea

17、d-caspase-3蛋白的表達出現(xiàn)了相應的上調;同時Bax表達出現(xiàn)明顯上調，相反，Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下調。在應用SP600125預處理后，上述蛋白的變化情況有所減小。8、SP600125可以增強TNF-α處理后BMSCs的遷移能力。Transwell細胞遷移實驗顯示，與陰性對照組相比，TNF-α處理后的細胞穿過小室的數(shù)量明顯減少，SP600125預處理后的細胞較單獨用TNF-α處理組穿過小室明顯增多。9、成軟骨分化過程中各組細胞活

18、性無顯著差異。在成軟骨分化過程中，不同時間點細胞的活性無顯著的統(tǒng)計學差異。10、SP600125能提高TNF-α處理后細胞成軟骨相關基因Agc、Sox9的表達。實施定量PCR結果顯示，Agc和Sox9兩個成軟骨相關基因在TNF-α出現(xiàn)的情況下表達明顯下調，而SP600125處理后的細胞，這兩種基因表達情況較單獨用TNF-α處理組顯著增高。11、較單獨用TNF-α處理組相比，SP600125使得細胞被阿利新藍染色更明顯。細胞成軟骨分化后形

19、態(tài)由原來的長梭形變成多角形或圓形，同時貼壁能力下降，可以被阿利新藍染成藍色。同單獨用TNF-α處理組相比，SP600125使得細胞被阿利新藍染色更明顯。12、同單獨用TNF-α處理相比，加入SP600125后細胞誘導成的軟骨球較大。3D培養(yǎng)法誘導成軟骨分化結果顯示，加入TNF-α后誘導的細胞團形狀不規(guī)則，體積較陰性對照組小;使用SP600125處理后，細胞團變得更接近球形，同時體積也較獨用TNF-α處理組大。13、3D培養(yǎng)法細胞成軟骨分

20、化更完全。軟骨球冰凍切片后阿利新藍染色結果顯示，總體的阿利新藍染色更充分。同單獨用TNF-α處理組相比，SP600125使得細胞被阿利新監(jiān)染色更明顯。14、用SP600125預處理的細胞Col2a1表達量較單獨用TNF-α處理組相比明顯增多。免疫熒光結果顯示，同陰性對照組相比，用含有TNF-α的培養(yǎng)基誘導分化后，Col2a1在細胞內的表達量明顯減低。同單獨用TNF-α處理組相比，加用SP600125處理后細胞的Col2a1表達量顯著增加

21、。15、較單獨用TNF-α處理組，SP600125增加了Agc和Col2a1蛋白表達量，同時降低了MMP-1、MMP-3以及MMP-13的蛋白表達量。Western blot結果顯示，TNF-α可以降低Agc和Col2a1兩種成軟骨相關蛋白的表達量，應用了SP600125后這兩種蛋白的表達有所回升。此外，TNF-α可以增加MMP-1、 MMP-3以及MMP-13的蛋白表達量，SP600125的使用使得這些炎癥相關蛋白表達量下降。