新型PDK1抑制劑對多發(fā)性骨髓瘤的殺傷作用及分子機制研究.pdf

1、第一部分 PDK1抑制劑GSK2334470單藥及聯(lián)合mTOR抑制劑PP242的抗骨髓瘤作用研究
　　目的:
　　研究PDK1抑制劑GSK-470的抗骨髓瘤作用及其分子機制;通過體內(nèi)外實驗，探討GSK2334470協(xié)同mTOR抑制劑PP242抑制骨髓瘤細胞生長和誘導細胞凋亡的作用和機制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測GSK2334470和/或PP242對多發(fā)性骨髓瘤(multiplymyeloma，MM)細胞

2、株和患者原代細胞的生長抑制作用;流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡;Western blot檢測Caspase-3/8/9、PARP、PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相關蛋白的表達情況。構建RPMI8226細胞荷瘤小鼠模型，檢測GSK2334470和/或PP242對小鼠瘤體生長的影響。
　　結果:
　　1.GSK2334470可以抑制骨髓瘤細胞株及原代MM患者細胞生長，呈濃度依賴性;對正常細胞株無明顯

3、毒性作用。
　　2.外源性IL-6和IGF-1不能逆轉GSK2334470對骨髓瘤細胞株的殺傷作用。
　　3.GSK2334470可以誘導MM細胞株和原代細胞發(fā)生凋亡，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP被激活。
　　4.GSK2334470通過抑制PDK1的磷酸化來調節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白。
　　5.GSK2334470可以協(xié)同PP242殺傷骨髓瘤細胞株和原

4、代細胞，誘導細胞凋亡。
　　6.PP242通過抑制mTORC2、下調Akt第473位點上絲氨酸的磷酸化來增強GSK2334470的抗骨髓瘤作用，兩者聯(lián)用完全抑制了Akt和mTORC1/C2的活性。
　　7.GSK2334470、PP242均可抑制MM荷瘤小鼠瘤體的生長，但聯(lián)合組的抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計學意義;聯(lián)合組瘤體的mTORC1和mTORC2的活性都有明顯下降。
　　第二部分 PTEN在PDK1抑制劑GSK23

5、34470抗骨髓瘤作用中的重要性研究
　　目的:
　　研究和比較GSK2334470對四種MM細胞株殺傷作用的差異及其與PTEN基因的關系;通過腺病毒或藥物改變骨髓瘤細胞中PTEN蛋白的水平來進一步證實PTEN在GSK2334470抗骨髓瘤作用中重要性;研究GSK2334470與蛋白酶體抑制劑MG132的協(xié)同抗骨髓瘤作用及其機制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測生長抑制作用;流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染

6、法檢測細胞凋亡;PCR和Western b1ot檢測MM細胞株PTEN的本底表達;腺病毒轉染使MM細胞株過表達或低表達PTEN;Western blot檢測胞漿PTEN、胞核PTEN及PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相關蛋白的表達情況。激光共聚焦檢測PTEN蛋白在細胞內(nèi)的分布。
　　結果:
　　1.GSK2334470對四種骨髓瘤細胞殺傷作用有明顯的差異，對ARP-1和MM.1R較敏感;ARP-1、MM.1R凋亡細胞

7、比例也明顯高于RPMI8226和OPM-2;與細胞株的PTEN表達呈正相關。
　　2.通過腺病毒轉染改變MM細胞株PTEN的表達，可改變GSK2334470的敏感性。
　　3.MG132通過增加細胞中PTEN的表達，調節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白，協(xié)同GSK2334470殺傷骨髓瘤細胞，誘導凋亡。
　　4.GSK2334470可以使MM細胞株胞漿中高表達的PTEN向細胞核轉移，明確了GSK2334470

8、抗骨髓瘤作用的其他機制，與MG132協(xié)同抗骨髓瘤的分子機制。
　　結論:
　　GSK2334470通過抑制PDK1的磷酸化來調節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路，誘導骨髓瘤細胞凋亡;mTOR抑制劑PP242通過抑制mTORC2和p-Akt S473的磷酸化協(xié)同GSK2334470發(fā)揮抗骨髓瘤作用。GSK2334470的敏感性與MM細胞內(nèi)PTEN的表達水平有關;可通過蛋白酶體抑制劑MG132或腺病毒轉染增加細胞內(nèi)PTEN的表達提