不同飼養(yǎng)層對人胚胎干細胞分化為多巴胺能神經元的影響.pdf

1、研究目的：
　　小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)和人包皮成纖維細胞(HFFs)是人類胚胎干細胞(hESCs)建系和維持最常用的飼養(yǎng)層。MEFs和HFFs在hESCs增殖和狀態(tài)維持方面均有差異，且對hESCs的心肌細胞分化潛能有影響。本研究目的是評價MEFs和HFFs對hESCs的多巴胺能神經分化的影響。
　　研究方法：
　　為了使培養(yǎng)條件變異對神經分化影響的最小化，本研究選用了自有的、在MEFs建系的HN4人胚胎干細胞系

2、和在混合飼養(yǎng)層(MFCs，MEFs∶HFFs=1∶1)建系的P96人胚胎干細胞系。分化實驗在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)中完成。采用SMAD通道雙抑制劑誘導啟動多巴胺能神經分化，采用倒置相差顯微鏡、免疫細胞化學法、實時熒光定量PCR、掃描電鏡和透射電鏡、以及膜片鉗等檢測方法從形態(tài)學、分子生物學標記物、轉錄因子基因表達、三維超微結構、電生理特性等方面分析人胚胎干細胞源多巴胺能神經元的各種特征。通過SPSS19.0軟件進行分析。P＜0.05認為有統(tǒng)計學

3、差異。
　　研究結果：
　　HN4和P96細胞系在分化過程中均表現(xiàn)出從典型鋪路石樣、高核質比的干細胞形態(tài)分化為典型神經元的形態(tài)學變化過程。HN4和P96源神經元均表達多巴胺脫羧酶(TH)陽性，P96系分化細胞中TH陽性細胞比率更高(P＜0.05)。掃描電鏡和透射電鏡結果顯示HN4和P96源多巴胺能神經元均顯示典型的神經元形態(tài)及突觸結構，并形成復雜的神經網絡。實時熒光定量PCR結果顯示，與HN4神經元相比，P96神經元FOXA

4、2、PITX3、NURR1、TH表達上調(P＜0.05)。膜片鉗結果顯示:在電壓鉗模式下，HN4和P96源多巴胺能神經元均記錄到了電壓門控性鈉、鉀離子電流，γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)等配體門控性電流及自發(fā)性突觸后電流。在電流鉗模式下，HN4和P96源多巴胺能神經元均記錄到了動作電位序列發(fā)放。動作電位發(fā)放的個數與去極化電流的強度均呈線性關系。HN4和P96源多巴胺能神經元動作電位時程均大于2mS。HN4和P96源多巴胺能神

5、經元靜息電位分別為-63.38±0.01和-58.7±0.04mV，閾電位分別為-36.15±0.34和-39.58±0.17mV，兩者差異呈顯著性。HN4和P96源多巴胺能神經元對去極化注射電流刺激均呈現(xiàn)出“爆發(fā)”性的放射模式，在連續(xù)發(fā)放的動作電位序列中，動作電位幅度遞減，而動作電位的時程逐漸延長。
　　研究結論：
　　1、在MEFs和HFFs上的建系的人胚胎干細胞系HN4及P96均可以分化為形態(tài)成熟的多巴胺能神經元，并且