肝癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的相互作用對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)第五大常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率極高，嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的健康。我國(guó)的肝癌患者占世界的一半以上，且80％的患者處于中晚期，預(yù)后差。肝癌的主要致死原因是侵襲和轉(zhuǎn)移，而在肝癌的遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移中，肺轉(zhuǎn)移占主要部分。“種子-土壤”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程與腫瘤微環(huán)境關(guān)系密切。因此，進(jìn)一步深入研究肝癌微環(huán)境對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)臨床靶向肺轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療具有潛在的重要意義。
　　腫瘤微環(huán)境是指腫瘤發(fā)生發(fā)展

2、過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境，包括腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和多種細(xì)胞因子等成分。腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞之間的交互作用，是腫瘤細(xì)胞調(diào)控腫瘤微環(huán)境的重要過(guò)程，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展有著極其重要的意義。在非腫瘤細(xì)胞中，成纖維細(xì)胞是主要成分，其活化形式即腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，能夠?yàn)槟[瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)支持和多種活性因子，參與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等多個(gè)方面的調(diào)控。在腫瘤微環(huán)境中，除了細(xì)胞因子發(fā)揮作用之外，外泌體作為重要的信息媒介，成為

3、近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。外泌體是細(xì)胞生成的一種直徑在30到100納米的囊泡，其內(nèi)包含有多種核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)，是介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞之間生物信息交流的重要介質(zhì)，在腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　然而，在肝癌肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中，肝癌細(xì)胞如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境以促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移形成，目前尚不清楚。尤其是肝癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間交互作用對(duì)肺轉(zhuǎn)移形成的影響，以及肝癌微環(huán)境中外泌體對(duì)介導(dǎo)肝癌肺轉(zhuǎn)移過(guò)程的影響均無(wú)系統(tǒng)研究闡明。并且，肝癌

4、細(xì)胞在肺轉(zhuǎn)移形成能力上存在較大異質(zhì)性，這一點(diǎn)是否與肝癌細(xì)胞對(duì)微環(huán)境特別是成纖維細(xì)胞的教化能力不同有關(guān)，亦缺少相關(guān)研究證實(shí)。因此，深入研究肝癌細(xì)胞對(duì)微環(huán)境中成纖維細(xì)胞的調(diào)控及其機(jī)制，對(duì)理解肝癌肺轉(zhuǎn)移異質(zhì)性，在臨床治療及預(yù)后判斷方面具有重要價(jià)值。
　　本研究基于肝癌肺轉(zhuǎn)移存在異質(zhì)性這一現(xiàn)象，系統(tǒng)研究了不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的教化能力差異，提出了高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞交互作用的具體機(jī)制。本研究將有助于進(jìn)一步理解肝癌肺轉(zhuǎn)移

5、的具體過(guò)程，為臨床肝癌肺轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　研究方法:
　　1、選取常見(jiàn)四種肝癌細(xì)胞并通過(guò)尾靜脈注射建立體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型，根據(jù)肺轉(zhuǎn)移形成能力高低，分為高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞和低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞;
　　2、在體外，收集肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基及外泌體，分別刺激人胚肺成纖維細(xì)胞，比較轉(zhuǎn)移能力差異對(duì)成纖維細(xì)胞招募及激活能力差異的影響，以及外泌體在肝癌細(xì)胞教化成纖維細(xì)胞過(guò)程的作用;
　　3、通過(guò)尾靜脈注射建立肝癌細(xì)胞SMMC

6、-7721的肺轉(zhuǎn)移模型，隨機(jī)分組后分別給予所選四種肝癌細(xì)胞的外泌體及對(duì)照處理，比較不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響;
　　4、通過(guò)收集所選四種肝癌細(xì)胞的外泌體并進(jìn)行miRNA芯片測(cè)試，分析其表達(dá)差異并結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)篩選高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞教化成纖維細(xì)胞過(guò)程中的關(guān)鍵miRNA;
　　5、通過(guò)miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)并結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)，篩選上述關(guān)鍵miRNA在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮活化作用的直接靶點(diǎn);
　　6、通過(guò)蛋白免疫印跡技

7、術(shù)及報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，進(jìn)一步研究該miRNA在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮作用的主要信號(hào)通路;
　　7、通過(guò)建立腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)模型，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞干性、EMT及腫瘤生長(zhǎng)的影響;
　　8、通過(guò)分離培養(yǎng)原代腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞干性、EMT及腫瘤生長(zhǎng)的影響;
　　9、收集臨床肝癌組織及血清樣本，檢測(cè)上述miRNA的臨床樣本中的表達(dá)情況及對(duì)臨床預(yù)后的相關(guān)性，分析血清外泌體中該miRNA的表達(dá)與肝癌肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

8、
　　結(jié)果:
　　1、高轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的招募及活化成纖維細(xì)胞以促進(jìn)肝癌肺轉(zhuǎn)移的能力;
　　2、高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有更強(qiáng)的招募及活化成纖維細(xì)胞的能力，繼而促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移的形成;
　　3、高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞生成含有miR-1247-3p的外泌體介導(dǎo)了肺轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的正常成纖維細(xì)胞的活化;
　　4、β1，4亞基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3是腫瘤細(xì)胞教化成纖維細(xì)胞過(guò)程中miR-1247-3p的直接作用靶點(diǎn);

9、　　5、miR-1247-3p通過(guò)靶向β1，4亞基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3，繼而上調(diào)β1型整合素-NF-κB信號(hào)通路，以激活成纖維細(xì)胞;
　　6、活化后的成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8分泌能力增強(qiáng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性、EMT和腫瘤生長(zhǎng);
　　7、血清外泌體中miR-1247-3p的表達(dá)與肝癌肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　本研究通過(guò)不同轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的教化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的招募并激活成纖

10、維細(xì)胞的能力。具體機(jī)制為，高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞能特異性生成含有大量miR-1247-3p的外泌體，后者被成纖維細(xì)胞攝取后，miR-1247-3p通過(guò)靶向β1，4亞基半乳糖轉(zhuǎn)移酶3，進(jìn)而上調(diào)β1型整合素-NF-κB信號(hào)通路，從而激活成纖維細(xì)胞?；罨蟮哪[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8分泌能力增強(qiáng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性、EMT及腫瘤生長(zhǎng)。在臨床肝癌患者的血清外泌體樣本中，miR-1247-3p的表達(dá)與肝癌肺轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)關(guān)系。本研究證實(shí)了，在