Progranulin在股骨頭壞死軟骨退變及骨肉瘤中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、股骨頭壞死(Osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，病變?cè)缙诨颊咭泽y關(guān)節(jié)疼痛及活動(dòng)障礙為主要臨床表現(xiàn)，隨著病情逐漸加重，逐漸累及關(guān)節(jié)間隙使間隙變窄、致髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎、甚至股骨頭變形塌陷、關(guān)節(jié)融合，給患者生活帶來巨大影響，后期往往需要行髓心減壓、關(guān)節(jié)融合、關(guān)節(jié)置換等手術(shù)治療。髖關(guān)節(jié)外傷股骨頸骨折、大量攝入酒精、長(zhǎng)期大量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、減壓病等是股骨頭壞死的常見病因，但其確切的病理發(fā)

2、病機(jī)制尚不完全清楚，血管損傷血運(yùn)障礙學(xué)說、脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說等是研究較多的關(guān)于發(fā)病機(jī)制學(xué)說，隨著基因分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)逐漸向微觀方向發(fā)展、逐漸深入到分子基因水平。前期研究發(fā)現(xiàn)在壞死的股骨頭骨質(zhì)及關(guān)節(jié)液中多種炎癥因子高表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在股骨頭壞死患者關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)軟骨降解產(chǎn)物，軟骨退變被證實(shí)在股骨頭壞死病變?cè)缙谝呀?jīng)開始發(fā)生，說明股骨頭壞死病變是一個(gè)整體，涉及到股骨頭骨質(zhì)、關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)液以及相關(guān)的炎癥因子，炎癥反應(yīng)和軟骨退

3、變參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于軟骨退變?nèi)绾伟l(fā)生、炎癥反應(yīng)如何起作用尚不明確。為了進(jìn)一步加深對(duì)股骨頭壞死病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，應(yīng)重視軟骨退變?cè)诩膊∵M(jìn)展中的作用，并研究軟骨退變及炎癥反應(yīng)在病變過程中作用機(jī)制。
　　骨肉瘤(Osteosarcoma)是骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，青少年患者多發(fā)，每年每百萬人中約有6-8個(gè)新發(fā)病患者。由于腫瘤惡性程度高、易復(fù)發(fā)、易耐藥、易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，使治療效果不理想很難令人滿意。1970年以前

4、對(duì)骨肉瘤的治療以截肢作為最常用的治療方案，但僅有不到10％的5年生存率。目前國(guó)際上通用的標(biāo)準(zhǔn)的骨肉瘤治療方案是:術(shù)前新輔助化療盡量殺死骨肉瘤細(xì)胞并消滅微轉(zhuǎn)移灶、手術(shù)盡量完整徹底切除腫瘤、術(shù)后化療，治療效果有了明顯提高，但是自上世紀(jì)70年代以來五年生存率一直維持在60％-70％左右，未有明顯改善，因此為了改善骨肉瘤患者的預(yù)后、提高患者的生活質(zhì)量迫切需要研制新的藥物和方法。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中，生長(zhǎng)因子及其激活的信號(hào)通路

5、發(fā)揮了較大的作用，因此生長(zhǎng)因子及其激活的信號(hào)通路可以作為研究骨肉瘤治療的新思路。
　　Progranulin(PGRN)作為一種自分泌生長(zhǎng)因子，具有多種生物功能，表達(dá)于多種組織內(nèi)如上皮組織、神經(jīng)組織、軟骨組織及多種腫瘤組織內(nèi)，研究證實(shí):PGRN在軟骨細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖中起到重要作用;據(jù)報(bào)道，PGRN在多種腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，并對(duì)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、局部及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移起到重要作用。本研究目的是:檢測(cè)股骨頭壞死患者股骨頭軟骨及骨肉瘤中PG

6、RN的表達(dá)，并研究PGRN在股骨頭壞死軟骨退變及骨肉瘤中作用及機(jī)制，希望能夠發(fā)現(xiàn)新的診斷及治療靶點(diǎn)，以改進(jìn)診斷治療方案，本研究首次對(duì)PGRN在股骨頭壞死軟骨及骨肉瘤中的表達(dá)及作用進(jìn)行研究。
　　本研究分為兩部分:第一部分主要研究PGRN在股骨頭壞死軟骨退變中所起到的作用及機(jī)制;第二部分主要研究PGRN在骨肉瘤中的表達(dá)情況，以及PGRN對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲、遷移所起的作用及作用機(jī)制。
　　第—部分:股骨頭壞死軟骨退變中P

7、GRN表達(dá)及在病交中所起到的作用及機(jī)制研究目的:本研究的目的在于研究PGRN在股骨頭壞死軟骨及血清中的表達(dá)情況，探討其在股骨頭壞死軟骨退變中的作用及其作用機(jī)制。
　　研究方法:分別收集股骨頭和血清標(biāo)本，股骨頭壞死患者作為實(shí)驗(yàn)組、股骨頸骨折患者作為對(duì)照組，分別應(yīng)用免疫組化、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot技術(shù))、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PGRN在軟骨中的表達(dá)、利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中PGRN

8、的濃度;體外實(shí)驗(yàn):提取并培養(yǎng)股骨頭壞死軟骨細(xì)胞并加入PGRN刺激，檢測(cè)aggrecan和collagenⅡ等軟骨合成代謝產(chǎn)物的表達(dá)情況，及信號(hào)通路ERK1/2的激活情況。
　　研究結(jié)果:1.經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測(cè)及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)示:股骨頭壞死組軟骨中PGRN的表達(dá)較股骨頸骨折組明顯增加，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)實(shí)驗(yàn)示:實(shí)驗(yàn)組血清中PGRN濃度高于對(duì)照組;2.經(jīng)免疫

9、組化和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)示:腫瘤壞死因子（TNF-α）在股骨肉壞死關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液中表達(dá)高于對(duì)照組;3.重組PGRN能夠拮抗腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激所導(dǎo)致的軟骨分解代謝4.重組PGRN能夠激活信號(hào)通路ERK1/2，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成aggrecan和collagenⅡ，對(duì)軟骨細(xì)胞合成代謝起促進(jìn)作用，在股骨頭壞死軟骨退變中起到一定的保護(hù)作用。
　　研究結(jié)論:PGRN能夠改善軟骨細(xì)胞的合成代謝、抑制分解代謝，在股骨

10、頭壞死軟骨退變病理進(jìn)程中起到軟骨保護(hù)作用，此次研究加深了股骨頭壞死病變過程中對(duì)軟骨退變及PGRN對(duì)軟骨退變保護(hù)作用的認(rèn)識(shí)。
　　第二部分:骨肉瘤中PGRN的表達(dá)，PGRN在骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、遷移中的作用及作用機(jī)制。
　　研究目的:本研究的目的在于研究PGRN在骨肉瘤細(xì)胞、病人血清及骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，并研究其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及遷移的作用及相關(guān)機(jī)制。研究方法:收集骨肉瘤及瘤旁組織標(biāo)本，經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)免疫印

11、跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織中PGRN的表達(dá);收集骨肉瘤患者及正常志愿者血清，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)比兩組血清中PGRN濃度;經(jīng)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGRN在骨肉瘤細(xì)胞中的是否表達(dá)，PGRN對(duì)骨肉瘤細(xì)胞活性、增殖的影響，是通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的;對(duì)骨肉瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲及遷移的影響是通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)的:利用重組PGRN刺激骨肉瘤細(xì)胞

12、并檢測(cè)MMP-2及相關(guān)信號(hào)通路Akt及mTOR的表達(dá)激活情況。
　　研究結(jié)果:1.對(duì)兩組組織進(jìn)行免疫組化染色，提取兩組組織總蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)，提取兩組RNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)結(jié)果表明:骨肉瘤組織中PGRN表達(dá)明顯高于瘤旁組織;收集兩組患者血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果表明:血清中PGRN的濃度實(shí)驗(yàn)組高于健康對(duì)照組;對(duì)骨肉瘤HOS、Sao-2細(xì)胞系進(jìn)行免疫熒光染色，染

13、色證明PGRN在以上兩種骨肉瘤細(xì)胞系表達(dá);2.通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞周期檢測(cè)試驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):PGRN在骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲及遷移過程中起重要的促進(jìn)作用;3.隨著PGRN濃度的增高其促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)的作用逐漸增強(qiáng)，PGRN可以使Akt及mTOR信號(hào)通路快速磷酸化激活。
　　研究結(jié)論:研究中我們初次證實(shí)PGRN高表達(dá)于骨肉瘤織及患者血清，證實(shí)骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)PGRN，發(fā)現(xiàn)P