固氮施氏假單胞菌環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)代謝相關(guān)基因的功能鑒定.pdf

1、分類號(hào)：?jiǎn)挝淮a：10364密級(jí)：學(xué)號(hào)：13720355安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文固氮施氏假單胞菌環(huán)二鳥苷酸（cdiGMP）代謝相關(guān)基因的功能鑒定FunctionalacterizationofthecdiGMPMetabolismRelatedGenesftheNitrogenfixingPseudomonasstutzeri研究生：盧佳思指導(dǎo)教師：張?jiān)迫A副教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別：理學(xué)碩士專業(yè)名稱：細(xì)胞生物學(xué)研究方向：微生物細(xì)胞生

2、物學(xué)所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會(huì)主席：2016年6月I摘要環(huán)二鳥苷酸（cdiGMP）是一種廣泛存在于細(xì)菌中的第二信使，參與調(diào)節(jié)多種生理功能，包括細(xì)胞分化、信號(hào)傳遞、生物膜形成、致病因子產(chǎn)生以及群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控等。cdiGMP由兩個(gè)GTP分子經(jīng)環(huán)化酶（DGCs）合成，而被磷酸二酯酶（PDEs）降解。環(huán)化酶（GTPs）具有保守的GGDEF結(jié)構(gòu)域，磷酸二酯酶（PDEs）具有保守的EAL結(jié)構(gòu)域。在銅綠假單胞菌中sadC為cdiGMP合成的

3、關(guān)鍵基因，而bifA基因?yàn)閏diGMP的降解基因，這兩個(gè)基因分別參與了胞內(nèi)cdiGMP的濃度調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響菌體的運(yùn)動(dòng)、生物膜形成等表型。施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzei）A1501是一株根際聯(lián)合固氮菌，cdiGMP在該菌中的合成、降解機(jī)制還未得到鑒定。為研究A1501菌cdiGMP的合成和降解途徑及其對(duì)菌株的影響，本研究將A1501中與銅綠假單胞菌sadC和bifA高度同源的兩個(gè)功能基因作為研究對(duì)象。通過(guò)構(gòu)建sadC和

4、bifA功能缺失突變株，測(cè)定突變株胞內(nèi)的cdiGMP濃度，進(jìn)而分析cdiGMP水平的變化對(duì)菌體運(yùn)動(dòng)、生物膜形成等生理功能的影響。取得的主要研究結(jié)果如下：1、基因組分析表明，A1501中含有編碼GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白的基因共有33個(gè)，含有編碼EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的基因有17個(gè)，其中編號(hào)為PST_3133的基因編碼氨基酸序列中含有一個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域和一個(gè)EAL結(jié)構(gòu)域，與銅綠假單胞菌BifA氨基酸序列同源性高達(dá)74%，將其命名為bifA。編號(hào)為P

5、ST_1148的基因編碼包含一個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域的蛋白，與銅綠假單胞菌中已報(bào)道的cdiGMP環(huán)化酶SadC同源性達(dá)到62%，將其命名為sadC基因。采用三親結(jié)合的方法分別構(gòu)建了bifA、sadC功能缺失突變株，以及sadC過(guò)表達(dá)株和突變株bifA的功能回補(bǔ)株進(jìn)行后續(xù)研究。2、對(duì)sadC突變株的胞內(nèi)cdiGMP含量及表型進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明sadC的功能缺失對(duì)菌體胞內(nèi)cdiGMP含量與野生型相比沒有明顯差異，而且對(duì)菌株的生物膜形成能力以及

6、固氮能力沒有顯著影響，但是菌體運(yùn)動(dòng)能力下降；透射電鏡觀察結(jié)果表明，sadC突變株與野生型的鞭毛形態(tài)沒有明顯差異。對(duì)sadC過(guò)表達(dá)菌株的生物膜形成能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明sadC過(guò)表達(dá)菌株的生物膜形成能力比野生型增強(qiáng)約2倍以上。通過(guò)測(cè)定sadC過(guò)表達(dá)株胞內(nèi)cdiGMP含量發(fā)現(xiàn)sadC過(guò)表達(dá)株胞內(nèi)cdiGMP含量與野生型相比，提高約140%，說(shuō)明sadC參與了A1501菌體內(nèi)的cdiGMP合成途徑。3、測(cè)定bifA突變株的胞內(nèi)cdiGMP含量