同型半胱氨酸誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及線粒體應激調(diào)控大鼠心肌細胞凋亡及牛磺酸干預的研究.pdf

1、高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia,HHcy）是心血管疾病的獨立危險因素，中等程度的血清同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）水平升高即可增加罹患心衰的風險。受飲食習慣的影響，我國人群Hcy水平普遍高于西方國家，其中以輕中度HHcy在臨床上較為常見。目前，由于人們并未足夠重視HHcy對心血管的危害作用，導致血清Hcy水平未能得到及時有效干預，使心血管受到不可逆的損傷，促進了心血管不良事件的發(fā)生。雖然升

2、高的Hcy水平可誘導血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞損傷，促進血栓形成，導致動脈血栓事件發(fā)生已被廣泛證實，但是升高的Hcy水平對心肌細胞影響如何目前研究尚不充分。我們前期研究表明，輕中度HHcy可促進高血壓對心臟的損害，加重高血壓患者的左室重構(gòu)，導致高血壓患者心功能明顯降低。然而，HHcy單獨存在能否對心肌細胞造成損傷，從而影響心臟結(jié)構(gòu)與功能，以及其分子生物學機制如何目前尚不可知。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulu

3、m stress,ERS）過度激活可誘導細胞凋亡，該機制是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。缺血缺氧、高血壓及高糖血癥等都可激活心肌細胞ERS，過度或持久的ERS可誘導促凋亡因子的表達，調(diào)控心肌細胞凋亡，從而影響心臟結(jié)構(gòu)及功能。我們前期研究表明，HHcy可加重高血壓誘導的心肌細胞ERS，引起促凋亡因子caspase-12及C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）表達明顯上調(diào)，激活了促凋亡信號通

4、路，可能調(diào)控了心肌細胞凋亡，因此促進了高血壓大鼠心肌重構(gòu)。然而，HHcy單獨作用于心臟時是否能激活心肌細胞ERS，以及激活的ERS是否直接了調(diào)控心肌細胞凋亡目前尚不清楚。線粒體是心肌細胞另一重要的細胞器，除了產(chǎn)生維持細胞存活的ATP和調(diào)節(jié)細胞代謝之外，還在細胞凋亡和壞死過程中起關(guān)鍵作用。線粒體不僅參于了內(nèi)部凋亡途徑的觸發(fā)，也參于了外部凋亡途徑的放大。然而，Hcy是否引起心肌細胞線粒體功能障礙，并促進心肌細胞凋亡事件的發(fā)生目前尚不清楚。目

5、前研究表明，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間有密切的聯(lián)系，ERS可影響線粒體功能，因此有學者提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體軸的概念。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細胞Ca2+存儲重要場所，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+的紊亂是激活ERS的關(guān)鍵因素；過度的ERS可導致Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加，而胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加恰好是誘導線粒體應激導致線粒體功能障礙的重要原因。這可能是ERS與線粒體功能障礙間信號傳導機制之一，是否存在其它信號傳導機制目前尚在探索中。在HHcy

6、環(huán)境下，心肌細胞是否存在線粒體功能障礙，以及其與ERS間存在何種關(guān)系目前尚不可知。
　　?；撬崤cHcy同是含硫氨基酸，兩者有相同的生成途徑，卻對心血管發(fā)揮截然相反的作用。?；撬嵩谌梭w內(nèi)含量豐富，其中心臟中?；撬岷考s占體內(nèi)?；撬峥偭康?5％。研究表明，牛磺酸對心血管起保護作用，適量的?；撬嵫a充可發(fā)揮降壓、降脂及降糖的功效。?；撬嵋呀?jīng)被用于臨床治療心功能衰竭患者，據(jù)報道補充?；撬峥墒寡蟮攸S或者利尿劑不敏感的心衰患者獲益。?；撬峥赏ㄟ^

7、有效清除氧自由基、維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)及確保蛋白正確折疊發(fā)揮其保護功能。目前較多研究報道了?；撬峥梢种颇X細胞的ERS，改善線粒體功能障礙，治療腦功能相關(guān)疾病。然而，在HHcy環(huán)境下，?；撬崾欠衲鼙Ｗo心肌細胞線粒體功能及抑制心肌細胞ERS，從而改善心臟結(jié)構(gòu)及功能，目前尚不明確。
　　鑒于上述情況，本課題擬在已有文獻報道及前期工作的基礎(chǔ)上，首先通過建立HHcy大鼠模型觀察HHcy是否損害大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能，并探討ERS和線粒體應激在此

8、過程中所起的作用；觀察?；撬岣深A對HHcy大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的保護作用，并研究其保護心肌細胞的相關(guān)分子機制。其次，通過體外研究觀察Hcy對H9C2心肌細胞ERS的影響，探討其是否直接調(diào)控了細胞凋亡；觀察Hcy對H9C2心肌細胞線粒體功能的影響，探討其是否促進了細胞凋亡事件的發(fā)生，以及初步探討其與ERS之間潛在信號傳導機制；通過觀察?；撬釋9C2心肌細胞ERS及線粒體應激的干預作用，探討?；撬釋笻cy心肌細胞毒性作用的分子機制。

9、>　　第一部分、動物實驗
　　HHcy誘導大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能變化的分子機制及?；撬岣深A的研究
　　目的：研究HHcy對大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能的影響，以及探討ERS和線粒體應激在此過程中所起作用；研究HHcy環(huán)境下，牛磺酸對心肌細胞的保護作用及保護機制。
　　方法：將30只Wistar大鼠隨機分為三組，分別為對照組：普通顆粒飼料喂養(yǎng)及飲用自來水；高蛋氨酸組：含3%蛋氨酸顆粒料喂養(yǎng)及飲用自來水；?；撬峤M：含3%蛋氨酸顆粒料喂養(yǎng)

10、及飲用含?；撬?% w/v的自來水。各組大鼠飼養(yǎng)第20周末，分別采用無創(chuàng)鼠尾動脈血壓儀檢測大鼠心率及SBP；便攜式Hcy檢測儀檢測血清Hcy水平；小動物超聲檢測大鼠心臟功能；頸動脈插管檢測心臟血流動力；免疫組化檢測GRP78、CRT、Bcl-2及Bax在心肌中表達；Western blot檢測TUAT、GRP78、CRT、caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、caspase-3及Cyt c在心肌中蛋白表達水平；柱前衍生化反

11、相高效液相色譜法測定心肌組織?；撬岷?；TUNEL檢測心肌細胞凋亡情況；掃描電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：（1）高蛋氨酸組大鼠血清Hcy水平為48.76±8.33μmol/L顯著高于對照組8.12±3.45μmol/L（P＜0.01），?；撬峤M血清Hcy水平為34.58±5.04μmol/L低于高蛋氨酸組（P＜0.05）。（2）高蛋氨酸組大鼠心臟功能指標LVEF及LVFS明顯低于對照組（P＜0.05），?；撬峤MLVEF及L

12、VFS明顯高于高蛋氨酸組（P＜0.05）。（3）高蛋氨酸組大鼠心臟血流動力學指標LVSP及±dp/dtmax明顯低于對照組（P＜0.05），LVEDP顯著高于對照組（P＜0.01）；牛磺酸組LVSP及±dp/dtmax明顯高于高蛋氨酸組（P＜0.05）， LVEDP明顯低于高蛋氨酸組（P＜0.05）。（4）免疫組化檢測結(jié)果顯示，高蛋氨酸組大鼠心肌組織GRP78及CRT表達顯著高于對照組（P＜0.01），牛磺酸組明顯低于高蛋氨酸組（P＜0

13、.05）；高蛋氨酸組Bcl-2及Bax表達顯著高于對照組（P＜0.01），?；撬峤MBcl-2及Bax表達分別明顯低于高蛋氨酸組（P＜0.05，P＜0.01）。（5）Western blot檢測結(jié)果顯示，高蛋氨酸組大鼠心肌組織GRP78、CRT蛋白表達水平均明顯高于對照組（P＜0.05），TAUT、CHOP、cleaved caspase-12、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及胞質(zhì)內(nèi)Cyt c均顯著高于對照組（P＜

14、0.01）；?；撬峤MTAUT、GRP78、CRT、CHOP、cleaved caspase-12、Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3蛋白表達水平均明顯低于高蛋氨酸組（P＜0.05），胞質(zhì)內(nèi)Cyt c蛋白表達水平顯著低于高蛋氨酸組（P＜0.01）。（6）高蛋氨酸組大鼠心肌組織?；撬岷匡@著低于對照組（P＜0.01），?；撬峤M心肌組織?；撬岷棵黠@高于高蛋氨酸組（P＜0.05）。（7）對照組未見TUNEL陽性染色心肌細胞

15、核；高蛋氨酸組TUNEL陽性染色心肌細胞核數(shù)量較多；?；撬峤MTUNEL陽性染色心肌細胞核數(shù)量較少。（8）對照組大鼠心肌纖維排列整齊，線粒體形態(tài)規(guī)則；高蛋氨酸組心肌纖維排列紊亂，線粒體腫脹甚至有融合現(xiàn)象；?；撬峤M心肌纖維排列較整齊，線粒體腫脹甚至有融合現(xiàn)象明顯改善。
　　結(jié)論：HHcy可誘導心肌細胞凋亡，損害大鼠心肌結(jié)構(gòu)及降低心臟功能，其潛在分子機制可能與ERS及線粒體應激激活有關(guān)；牛磺酸可抑制HHcy誘導的心肌細胞凋亡，改善大鼠心

16、肌結(jié)構(gòu)與功能，其保護機制可能與緩解ERS及線粒體應激有關(guān)。
　　第二部分、細胞實驗
　　Hcy誘導ERS及線粒體應激調(diào)控H9C2心肌細胞凋亡及?；撬岣深A研究
　　目的：研究Hcy對H9C2心肌細胞ERS及線粒體應激的影響，探討ERS激活、線粒體應激及心肌細胞凋亡之間的關(guān)系；研究牛酸酸對 Hcy誘導的心肌細胞保護作用及保護機制。
　　方法：使用Hcy處理H9C2心肌細胞，觀察心肌細胞ERS相關(guān)蛋白表達的變化及線粒體

17、應激相關(guān)指標變化；使用2mM Hcy處理H9C2心肌細胞，觀察細胞內(nèi)Ca2+濃度變化；使用4-苯基丁酸（4-PBA）阻斷ERS，觀察心肌細胞凋亡率變化；使用salubrinal及si-PERK阻斷PERK信號通路，觀察線粒體應激相關(guān)蛋白表達、心肌細胞活力及凋亡率變化；使用牛磺酸預處理，觀察心肌細胞ERS相關(guān)蛋白表達的變化及線粒體應激相關(guān)指標變化。分別使用CCK-8檢測細胞活力；使用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率；使用

18、Fluo-4,AM Ca2+熒光探針檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度變化；使用JC-1檢測細胞線粒體膜電位變化；使用紅色線粒體內(nèi)ROS探針檢測線粒體內(nèi)ROS水平；使用綠色胞質(zhì)內(nèi)ROS探針檢測胞質(zhì)內(nèi)ROS水平變化；使用Western blot方法檢測蛋白表達水平變化，使用掃描電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：（1）與對照組比較，Hcy1.0-4.0mM可顯著降低心肌細胞活力，使心肌細胞活力從70.97%降低至47.54%（P＜0.01）；與對

19、照組相比，1.0、2.0及3.0mM處理可分別導致13.7%心肌細胞凋亡（P＜0.05）、16.7%心肌細胞凋亡（P＜0.01）及20.1%心肌細胞凋亡（P＜0.01）。與對照組比較，Hcy1.0mM干預12h時H9C2心肌細胞活力明顯下降（P＜0.05），干預24h及36h可導致心肌細胞活力從81.93%降低至54.55%（P＜0.01）。（2）2.0mM Hcy處理H9C2心肌細胞5min，可使細胞內(nèi)Ca2+熒光強度持續(xù)增強且出現(xiàn)脈

20、沖現(xiàn)象，單個細胞Ca2+熒光區(qū)域不斷變化。（3）Hcy低濃度及短時間處理H9C2心肌細胞可使ERS應激相關(guān)蛋白GRP78、p-IER1及p-eIF2α蛋白表達升高，使ERS應激相關(guān)蛋白ATF6 p90蛋白表達降低；Hcy高濃度及長時間處理H9C2心肌細胞可使ERS應激相關(guān)蛋白GRP78、p-IER1及 p-eIF2α蛋白表達降低，使ERS應激相關(guān)蛋白ATF4、CHOP、p-JNK及cleaved caspase-12蛋白表達升高（P＜0

21、.05，P＜0.01）。（4）Hcy高濃度及長時間處理可使線粒體應激相關(guān)指標細胞線粒體膜電位逐漸降低及胞質(zhì)內(nèi)Cyt c濃度升高；使cleaved caspase-9及cleaved caspase-3表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；可使線粒體及胞質(zhì)內(nèi)ROS熒光強度明顯增強。（5）通過使4-PBA干預后，Hcy誘導的H9C2心肌細胞CHOP、cleaved caspase-12及p-JNK蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.0

22、1），且使細胞凋亡率由11.6%降低至7.7%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（6）通過使salubrinal及si-PERK阻斷PERK通路后，Hcy誘導的H9C2心肌細胞凋亡率由15.5%降低至11.7%及由16.5%降低至10.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（7）通過使salubrinal阻斷PERK通路后，線粒體應激相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax蛋白表達比率顯著降低（P＜0.01），cleaved caspase-3蛋

23、白表達明顯降低（P＜0.05）。（8）牛磺酸預處理可使Hcy誘導的H9C2心肌細胞活力顯著升高（P＜0.01），使細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）；?；撬犷A處理可升高Hcy誘導的H9C2心肌細胞線粒體膜電位，減少細胞線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)生；Hcy1.0mM及2.0mM處理可引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體腫脹，甚至導致線粒體融合及胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，而?；撬犷A處理可明顯改善Hcy誘導的H9C2心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及線粒體融合現(xiàn)象。
　　結(jié)論：Hcy

24、誘導的ERS直接調(diào)控H9C2心肌細胞凋亡，其中PERK通路在ERS調(diào)控心肌細胞凋亡過程中起重要作用。2、Hcy可誘導H9C2心肌細胞線粒體應激，引起線粒體功能障礙，導致caspase依賴的級聯(lián)凋亡反應激活，可能促進了細胞凋亡事件的發(fā)生；另外，Ca2+紊亂及PERK通路可能可能是Hcy誘導的心肌細胞ERS及線粒體應激的紐帶。3、牛磺酸可有效保護Hcy誘導的H9C2大鼠心肌細胞，其保護機制可能與抑制Hcy誘導的心肌細胞ERS激活及緩解Hcy