鴨坦布蘇病毒E蛋白關鍵毒力位點的發(fā)現(xiàn)與鑒定.pdf

1、2010年于我國東南部沿海地區(qū)鴨養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)了抗原為鴨坦布蘇病毒的傳染性疾病，后來迅速流行于全國各地的主要鴨養(yǎng)殖區(qū)等(浙江、廣州、廣西、安徽、江蘇、山東、河北)。鴨群被感染后，癥狀表現(xiàn)產蛋下降、采食量降低、生長緩慢和典型的神經癥狀，鴨群感染率為100％，死亡率高達10~30%，對我國的鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失和對公共衛(wèi)生安全產生了安全隱患。鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV），屬于黃病毒科，黃病毒屬。黃病毒

2、屬包括乙型腦炎病毒（Janpanese encephalitis virus, JEV）、登革熱病毒（Dengue virus，DENV）、西尼羅病毒（West Nile virus）、黃熱病毒（yellow fever virus）等等。DTMUV基因是一條正鏈RNA，包含兩端的非編碼區(qū)（5’-UTR和3’UTR）和一個開放讀碼框，分別編碼結構蛋白：衣殼蛋白（C）、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）和包膜糖蛋白（E），7個非結構蛋白。目

3、前已經從雞、鵝、鴿子、鳥和蚊子體內分離出了此病毒，說明了DTMUV很可能已經獲得了跨種傳播的能力。根據(jù)最新研究DTMUV在哺乳動物細胞上連續(xù)傳代、小鼠體內正常復制尤其是肝、脾臟、腦等部位，小鼠臨床癥狀比較明顯，表現(xiàn)為黃病毒中典型的神經癥狀。另外由于黃病毒為人畜工感染的重要病原，而 DTMUV也可通過蚊蟲傳播，所以其很可能是一種潛在的人類病原體，非常有必要做好 DTMUV的跨種傳播感染人預防工作，研究其致病性和開發(fā)新的疫苗。
　　本

4、研究是通過探尋DTMUV中關鍵毒力位點，來探究DTMUV的致病機制和減毒策略，給減毒活疫苗的研制提供新的減毒靶點，為 DTMUV的爆發(fā)流行和跨種傳播人做好預防工作
　　本研究主要包括四部分：
　　一、DTMUV病毒的毒力位點分析與鑒定
　　本實驗通過小鼠顱內連續(xù)傳代 DTMUV病毒，發(fā)現(xiàn)了病毒的蝕斑能力出現(xiàn)了減弱的生物學。通過蝕斑純化技術，分離出DTMUV-L與 DTMUV-S，發(fā)現(xiàn)DTMUV-S的蝕斑能力和神經毒力有

5、明顯減弱的現(xiàn)象。通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，突變病毒的在E388位有一個絲氨酸（S）到精氨酸（R）的突變，其他核苷酸的突變位于非結構蛋白NS1和NS5中。根據(jù)有關研究證明，黃病毒屬中的E蛋白是病毒關鍵的毒力部位，在病毒感染過程中具有細胞吸附、膜融合等重要作用，包含多種抗原表位，是中和抗體結合的區(qū)域，所以確定了E蛋白388位突變位點的研究路線。
　　二、突變感染性克隆pS388R的構建
　　本實驗室已將DTMUV的結構基因prM和

6、E基因嵌合在乙腦病毒的感染性克隆載體上E70上，構建了嵌合感染性克隆pCJDTMUV。為探究該E388突變是否對鴨坦布蘇病毒的生物學特征有影響，在感染性克隆質粒 pCJDTMUV基礎之上，本實驗利用分子克隆技術，將E388位氨基酸由S突變?yōu)镽，構建了攜帶突變位點的感染性克隆質粒pS388R，并成功拯救獲得攜帶該突變的恢復病毒rS388R。
　　三、恢復病毒rS388R與親本病毒rWT株病毒的體外病毒特征對比
　　本研究評價了

7、恢復病毒rS388R體外水平的生物學特征。生長曲線上BHK-21、C6/36和SY-SH5Y細胞上沒有明顯的差異，但是在Vero，DF-1細胞系中發(fā)現(xiàn)rS388R的生長曲線明顯減弱；蝕斑形態(tài)上看rS388R病毒的蝕斑明顯減??；間接免疫熒光實驗表明兩株病毒在表達自身結構蛋白上沒有明顯差異；溫度穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)rS388R對溫度的變化更加敏感，病毒的結構穩(wěn)定性變弱；病毒的吸附實驗表明兩株病毒沒有明顯的差異，但肝素受體結合實驗中發(fā)現(xiàn)攜帶S388

8、R突變的病毒是依賴于結合宿主細胞中的硫酸乙酰肝素（HS）受體來完成病毒感染過程。
　　四、恢復病毒rS388R與親本病毒rWT的動物水平的評價
　　動物實驗結果說明rS388R病毒株的神經毒力和神經侵襲力都明顯弱于rWT親本株，能夠有效的誘導機體產生IgG抗體和中和抗體，而且具有良好的免疫保護結果。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)并探究了鴨坦布蘇病毒E388突變對病毒生物學特征和致病機制的影響，構建了攜帶突變位點的感染性克隆，