NLRP3炎癥體介導的小膠質細胞炎癥反應在錳神經(jīng)毒性中的作用.pdf

1、背景：
　　錳是人體所必須的微量元素。參與人體免疫反應，ATP的生成，骨骼生長等生理反應。此外，錳還可以作為機體許多酶的輔助因子，保障其發(fā)揮正常的生理作用。然而，當機體攝入過多的錳則會引起錳中毒的發(fā)生，其臨床表現(xiàn)主要為類似帕金森氏病病癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是錳作用人體的主要靶器官，黑質紋狀體通路更是錳損傷神經(jīng)系統(tǒng)的關鍵核團。形成了錳能夠引起黑質紋狀體內多巴胺能神經(jīng)元功能減弱的經(jīng)典理論。隨著人們對錳神經(jīng)毒性的進一步關注，錳對海馬腦區(qū)調控的

2、空間記憶能力損傷也漸漸被人們所證實。研究證實錳在大腦中的蓄積所造成的神經(jīng)毒性作用與阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森癥（Parkinson's disease，PD）、等多種神經(jīng)退行性疾病都有著密切的關系。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質細胞是免疫反應的關鍵細胞，主要來源于腦膜，脈絡叢以及血管周圍。其與巨噬細胞的功能相似，能通過一系列的模式識別受體（Pattern-Recognition Recep

3、tors, PRR）實時監(jiān)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內環(huán)境。當組織受損或有害物質入侵的情況下，小膠質細胞發(fā)生活化反應，一方面發(fā)揮吞噬作用，一方面釋放大量炎癥因子，誘導外周固有免疫細胞及適應性免疫細胞遷移至受損或入侵部位，發(fā)揮免疫防御作用。因此，小膠質細胞活化及炎性因子釋放在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應答防御反應中發(fā)揮了重要作用。小膠質細胞活化后能夠快速誘導出多種炎性因子，其中包括白介素-1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）、腫瘤壞死因

4、子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）和IL-18等。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，錳暴露能夠誘導小膠質細胞活化，活化后釋放的炎性因子可能是錳暴露導致神經(jīng)元損傷的關鍵因素，研究結果為錳神經(jīng)毒性機制闡明及錳中毒防護提供了重要線索。
　　炎癥體是近年來炎性疾病領域關注的重點，在炎性因子成熟、釋放過程中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥體是調控IL-1β、IL-18等炎性因子成熟釋放的重要途徑。在神經(jīng)炎癥中，小膠

5、質細胞和巨噬細胞內的NLRP3炎癥體能被β淀粉樣蛋白（Amyloid-beta，Aβ），α-共核蛋白（α-synuclein，α-syn）所激活?；罨腘LRP3發(fā)生寡聚化，募集接頭蛋白ASC，通多CARD結構域與PYD結構域相互作用，進一步激活caspase-1，進而加工pro-IL-1β為成熟的IL-1β，并釋放于細胞外發(fā)揮作用。
　　調控NLRP3炎癥體活化成熟的因素很多，細胞內ROS的增多、K+濃度改變、ATP水平降低以及

6、自噬等均能夠影響NLRP3炎癥體的活化。自噬是細胞維持內環(huán)境穩(wěn)定重要的生理過程。自噬的形成過程包括自噬的啟動、延伸、與溶酶體的融合和降解幾個重要階段。當自噬形成的某一過程受到抑制時則會導致自噬功能處于紊亂狀態(tài)。研究表明，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生都與自噬功能的異常相關，PD、AD等均發(fā)現(xiàn)體內自噬降解過程異常。自噬與NLRP3炎癥體之間的關系較為復雜，一方面當NLRP3炎癥體處于激活狀態(tài)時，則會促進自噬的發(fā)生；另一方面，自噬的過度活化則能夠抑

7、制 NLRP3炎癥體的活化。許多研究表明，自噬的抑制能夠活化 NLRP3炎癥體，促進pro-IL-1β（36kDa）向成熟IL-1β轉變。雖然自噬能夠調控NLRP3炎癥體的活化，但其具體機制至今尚未闡明，這也成為當今該領域研究的熱點和難點。
　　目的：
　　研究錳暴露誘導的小膠質細胞活化及其釋放的炎性因子在錳介導的學習記憶損傷中的作用；揭示NLRP3炎癥體活化是錳誘導小膠質細胞活化釋放炎性因子IL-1β和IL-18的關鍵環(huán)節(jié)

8、；闡明自噬溶酶體功能紊亂與NLRP3炎癥體活化之間的關系；揭示錳暴露誘導的自噬功能紊亂調控NLRP3炎癥體活化的具體機制，為錳神經(jīng)毒性的防護和治療提供關鍵靶點和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．通過皮下注射氯化錳的方法，構建錳暴露的小鼠體內模型，采用原子熒光光譜法檢測小鼠血錳和腦錳的濃度，運用恐懼條件箱以及電生理實驗評估小鼠錳暴露后學習和記憶能力的改變；
　　2．通過免疫熒光化學法檢測錳暴露后NLRP3炎癥體在小鼠海馬區(qū)

9、以及BV2細胞（之后簡稱為BV2）中的表達改變。Western blot檢測NLRP3炎癥體相關蛋白NLRP3、cleaved caspase-1，炎性因子IL-1β的表達改變；
　　3．通過ELISA檢測錳暴露后炎性因子IL-1β、IL-18和TNF-α的改變，以及qRT-PCR檢測NLRP3和炎性因子IL-1β、IL-18mRNA水平的改變。
　　4．通過免疫熒光化學法檢測自噬相關蛋白LC3的表達影響，Western b

10、lot檢測自噬相關蛋白Beclin1、Atg5、LC3、p62、組織蛋白酶B（cathepsin B）蛋白的變化。透射電鏡觀察BV2自噬亞細胞結構的改變；，
　　5．分別運用Atg5 siRNA、Baf A1以及NH4Cl處理BV2，Western blot檢測錳暴露后NLRP3炎癥體相關蛋白NLRP3、cleaved caspase-1，炎性因子IL-1β的表達改變，ELISA檢測錳暴露后炎性因子IL-1β、IL-18的改變。<

11、br>　　結果：
　　1．皮下注射氯化錳7天后，小鼠血錳和腦錳與對照組相比明顯升高，恐懼條件箱檢測以及LTP實驗發(fā)現(xiàn)錳暴露后能夠引起小鼠學習記憶能力下降；
　　2．海馬腦片以及BV2免疫熒光化學染色表明，錳暴露能夠引起NLRP3炎癥體表達增多。Western blot結果顯示，體內外錳暴露均能夠引起NLRP3炎癥體相關蛋白NLRP3、cleaved caspase-1表達的增加；
　　3．ELISA實驗檢測發(fā)現(xiàn)錳暴露能

12、夠誘導炎性因子IL-1β、IL-18表達增加，并且在mRNA水平檢測上也得以證實；
　　4．免疫細胞化學熒光染色結果提示，錳暴露可導致BV2內LC3標記的自噬體大量聚集。Western blot發(fā)現(xiàn)與對照組相比，錳暴露后自噬體相關蛋白Beclin1、Atg5、LC3II、p62、組織蛋白酶Bbiao’da表達顯著增加。p62升高提示錳暴露能夠引起自噬溶酶體降解功能出現(xiàn)障礙。組織蛋白酶 B的表達增加以及電鏡檢測所發(fā)現(xiàn)的溶酶體形態(tài)異常

13、提示錳暴露能夠引起B(yǎng)V2溶酶體功能異常。
　　5．Atg5 siRNA和Baf A1分別抑制自噬體的啟動、延伸和與溶酶體的融合后，并不能抑制錳暴露所誘導的NLRP3炎癥體的活化及IL-1β、IL-18的釋放。NH4Cl作用BV2后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)其能夠降低組織蛋白酶B的表達，抑制錳暴露所誘導的NLRP3炎癥體的活化以及炎性因子IL-1β、IL-18的釋放。
　　結論：
　　1．體內實驗證實錳能夠降低海

14、馬腦區(qū)所調控的學習和記憶能力。
　　2．錳暴露對學習記憶能力的影響可能與其所誘導的小膠質細胞活化后釋放的促炎性因子（IL-1β和IL-18等）有關。
　　3．錳暴露激活NLRP3炎癥體通路是其介導炎性因子釋放的關鍵因素。
　　4．自噬溶酶體功能紊亂參與了錳誘導的NLRP3炎癥體活化，自噬體啟動、延伸及與溶酶體融合的異常不是調控NLRP3炎癥體活化的重要環(huán)節(jié).
　　5．錳暴露導致的溶酶體功能異常及cathepsin