融合必需氨基酸多肽在魚腥藻PCC 7120中的表達及其條件優(yōu)化.pdf

1、魚腥藻PCC7120（Anabaenasp. PCC7120）屬于真細菌類中的一種進行產(chǎn)氧性光合自養(yǎng)，能固氮的革蘭氏陰性多細胞絲狀原核生物；其結構簡單，優(yōu)點諸多如培養(yǎng)簡單，生長周期短，易于基因工程改良等已成為分子生物學和基因工程研究中的重要模式生物和穩(wěn)定的基因表達宿主。同時魚腥藻PCC7120富含蛋白質(zhì)、核酸、脂類等多種營養(yǎng)要素，可作為動物飼料蛋白資源的開發(fā)和利用。本研究基于魚腥藻PCC7120遺傳學研究進展和動物飼料添加劑是氨基酸重要

2、終端市場，利用魚腥藻PCC7120偏愛密碼子設計了能特異性表達多種必需氨基酸組成小肽的外源目的HEP234基因片段并對其進行改良引入融合序列，通過基因工程手段體外構建含上述目的基因片段的融合序列，強啟動子的穿梭質(zhì)粒pHEP130并經(jīng)過三親結合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化魚腥藻PCC7120，篩選純化獲得質(zhì)粒穩(wěn)定性陽性轉(zhuǎn)基因藻株，對轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120進行分子水平的檢測和蛋白水平的誘導表達，印跡雜交鑒定，證實外源目的基因在轉(zhuǎn)基因藻株的存在。此外，逐一優(yōu)

3、化了轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120生長條件，確定了優(yōu)化條件培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)基因藻的外源目的基因表達效率有明顯提高。其中本研究主要結果如下：
　?。?）根據(jù)魚腥藻PCC7120偏愛密碼子設計了能特異性表達13種動物必需氨基酸組成小肽的外源目的HEP234基因片段，該基因片段總長78 bp；在此基礎上改良了HEP234使其N端引入TEV蛋白酶識別序列和GFP序列，C端引入His-tag標簽；含外源目的基因片段的融合序列總長為819 bp。實驗過

4、程初成功構建了含上述外源目的基因的融合序列，強啟動子Lac C的穿梭表達質(zhì)粒pHEP130，并通過三親結合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化魚腥藻PCC7120，經(jīng)3次純化篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因藻株。
　　（2）基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性是其高效表達目的基因產(chǎn)物的理論基礎。實驗過程中分別采用平板稀釋法和平板計數(shù)法綜合比對了有無選擇壓力培養(yǎng)下連續(xù)傳代 E.coli NEB10β::pHEP130和PCC7120::pHEP130的生長情況，并隨機挑取5代單克隆質(zhì)粒

5、PCR鑒定，結果證實E.coliNEB10β::pHEP130在147代質(zhì)粒未發(fā)生缺失，PCC7120::pHEP130在連續(xù)傳代10次仍能保持質(zhì)粒穩(wěn)定性。
　?。?）在實驗室常規(guī)培養(yǎng)條件（恒溫30℃，連續(xù)光照70μE m-2s-1，110 rpm振蕩）下得到了轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120有無氮源培養(yǎng)條件下的生長曲線，并確立了5~17d內(nèi)加氮條件下的轉(zhuǎn)基因藻生長速率明顯高于缺氮培養(yǎng)。故在后續(xù)實驗中，選取加氮條件下培養(yǎng)15d的轉(zhuǎn)基因魚

6、腥藻PCC7120進行目的基因融合蛋白的提取。
　?。?）純化后的陽性轉(zhuǎn)基因高效表達藻株通過誘導表達，破碎提取，Ni柱純化，親和層析等技術手段可獲得目的基因融合蛋白，其最佳獲取條件為1mmol/L誘導物IPTG誘導，超聲破碎破壁處理提取。最后通過TEV蛋白酶酶切鑒定可初步獲得目的小肽HEP234 Protein。
　?。?）采用單因素控制變量法逐一探究種子液、溫度、pH、光照、外源碳源、氮源對轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120生物量