p38MAPK基因沉默對唇裂術后瘢痕增生影響的實驗研究.pdf

1、目的:通過建立模擬人唇裂術后傷口愈合的兔上唇瘢痕模型，對此模型進行術后瘢痕生長的時間序列研究以明確兔上唇唇裂術后瘢痕增生最嚴重程度所在時間。通過構建p38MAPK基因沉默重組腺病毒干擾靶基因的表達，檢測不同時間點P38MAPK信號通路受阻后對兔模型上唇瘢痕的影響效果來尋找基因治療瘢痕的最佳時間以及探討Smad信號通路與p38MAPK之間的cross-talk(交叉對話）情況。從整體水平闡明腺病毒介導的p38MAPK基因沉默對兔上唇瘢痕模

2、型的治療性作用的分子機制。為開拓對我國唇裂術后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途徑奠定基礎。
　　方法:1.運用Millard's單側唇裂修復法完成兔上唇瘢痕模型的構建。
　　2.分別在術后2、3、4、5周測量瘢痕體積并進行肌成纖維細胞（MFB)的細胞計數，隨后通過免疫組織化學染色和Western blot定性和定量檢測兔上唇瘢痕組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA)的含量。
　　3.篩選p38MAPK基因沉默最有效sh

3、RNA序列及構建腺病毒載體。
　　4.術后0周、1周、2周分別進行瘢痕組織P38MAPK基因沉默腺病毒轉染，然后在術后3周獲取標本，用四種方法（天狼猩紅染色、免疫組織化學染色、Western blot、Real-time PCR)分別定性、定量檢測p38MAPK及瘢痕形成相關因子（coll、colIII、MMP1、TIMP1)的蛋白和mRNA的相對表達水平。
　　5.Y周時，用Western blot和Real-time P

4、CR檢測 Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、p38MAPK及p-p38MAPK的mRNA和蛋白的相對表達水平。
　　結果:1.成功構建兔上唇唇裂術后瘢痕模型。
　　2.瘢痕體積和MFB細胞計數結果顯示，術后2周與術后5周，術后3周與術后4周無統(tǒng)計學意義（P＞0.05),術后2周與術后3周及4周均有明顯統(tǒng)計學差異iP＜0.01)。免疫組化染色結果顯示：術后3周、4周瘢痕組織中α-SMA表達明顯多于術后2周

5、、5周。Western blot結果顯不：術后3周、4周瘢痕組織中α-SMA蛋白表達較術后2周、5周增強，結果具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。
　　3.成功篩選出p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列并構建了腺病毒載體。
　　4.局部注射腺病毒后，天狼猩紅染色結果示：術后1周瘢痕組織中colIII表達明顯多于術后0周及2周，術后1周瘢痕組織中coll表達明顯少于術后0周及2周。免疫組化染色結果顯亦：術后1周療痕組織中co

6、lIII、MMP1表達明顯多于術后0周及2周，術后1周瘢痕組織中coll、TIMP1表達明顯少于術后0周及2周。Western blot結果顯不：術后1周瘦痕組織中colIII及MMP1蛋白較術后0周及2周表達增強，術后1周瘢痕組織中p38MAPK、coll及TIMP1蛋白較術后0周及2周表達減弱。Real-time PCR結果示：術后1周瘢痕組織中colIII及MMP1的mRNA水平較術后0周及2周升高，術后1周瘢痕組織中p38MAP

7、K、coll及TIMP1的mRNA水平較術后0周及2周降低。
　　5.術后1周注射腺病毒，Western blot結果顯示：與對照組相比，術后1周瘢痕組織中p-Smad2、p-Smad3及p-p38MAPK蛋白表達降低。Real-time PCR結果不：術后1周瘢痕組織中Smad2、Smad3及p38MAPK的mRNA水平較對照組降低。
　　結論:為研究基因治療唇裂術后瘢痕增生提供了兔上唇瘢痕模型，通過實驗可得術后3周及4周