基于破骨細胞和成骨細胞調控通路探討左、右歸丸對不同性別去勢大鼠骨質疏松癥的作用差異及其機制.pdf

1、目的：從OPG/RANKL破骨細胞調控通路和Wnt/LRP-5/β-catenin成骨細胞調控通路的角度，揭示具有滋補腎陰作用的左歸丸和具有溫補腎陽作用的右歸丸對不同性別去勢大鼠骨質疏松癥的作用差異及其機制，以探討“腎主骨”是否存在性別差異以及產生差異的機理，進一步闡明“腎主骨”的科學內涵，并為采用中醫(yī)治療骨質疏松癥的臨床用藥提供實驗依據(jù)。
　　方法：選用同周齡SD大鼠160只，SPF級，雌雄各半，先隨機分為6組:雌、雄性空白對照

2、組各12只，雌、雄性假手術組各12只，雌、雄性造模組各56只。于去勢術前，先用Osteocore3 Digital2D骨密度儀（雙能X線）掃描所有大鼠腰椎4-6(L4-6) BMD，得到掃描圖像待分析。之后分別對兩組造模組大鼠行去勢手術，即對雌性造模組大鼠切除卵巢，對雄性造模組大鼠切除睪丸（其中雄性假手術組1只、造模組雌、雄性大鼠各3只因手術麻醉死亡）。術后，再將兩組造模組大鼠按體重隨機分為8組:卵巢切除組（OVX組）13只、睪丸切除(

3、ORX組)14只、戊酸雌二醇組（E2組）14只，甲睪酮組（T組）、雌、雄性左歸丸組、雌、雄性右歸丸組各13只。
　　OVX大鼠OP模型制作:采用戊巴比妥鈉腹腔注射全身麻醉雌性大鼠后，摘除雙側卵巢;雌性假手術組也施行開關腹腔手術，但未摘除卵巢，只摘除少量卵巢周圍脂肪組織。ORX大鼠OP模型制作:用戊巴比妥鈉腹腔注射全身麻醉雄性大鼠后，分離雙側睪丸和附睪并切除雙側睪丸;雄性假手術組也用同樣的方法找到并剝離雙側睪丸，但不摘除。
　

4、　術后10天，對各給藥組大鼠灌胃給藥:雌、雄性左歸丸組大鼠灌服左歸丸水煎液，給藥濃度為0.968g生藥/ml;雌、雄性右歸丸組大鼠灌服右歸丸水煎液，給藥濃度為1.024g生藥/ml;戊酸雌二醇組大鼠灌服戊酸雌二醇水溶液，濃度為0.0092 mg/ml;甲睪酮組大鼠灌服甲睪酮水溶液，濃度為0.092mg/ml。以上給藥體積均為1ml/100g體重，每周稱重一次，根據(jù)體重調整給藥體積，每天固定時間（下午2點）給藥，連續(xù)6天，休息1天后，再連

5、續(xù)給藥6天，如此給藥3個月。雌、雄空白對照組，雌、雄假手術組，OVX組、ORX組大鼠按上法灌服等體積的純凈水（雌性右歸丸組和雄性左歸丸組各有1只大鼠因灌胃操作不慎死亡）。
　　各組大鼠分別于處死前16天和前3天，腹腔注射鹽酸四環(huán)素（劑量為30mg/kg體重），對骨組織進行熒光雙標記。給藥結束后，將大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射進行全身麻醉，用骨密度儀掃描大鼠L4-6 BMD，得到掃描圖像待分析。然后，再將各組大鼠迅速處死，取右側脛骨近端

6、1/3，制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計量學指標的檢測;取左側脛骨近端1/3，制作脫鈣骨冰凍切片，采用免疫組化法和原位雜交法分別檢測OPG、RANKL、Wnt1、LRP-5、β-Catenin蛋白及其mRNA的檢測。
　　實驗結果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布時，采用單因素方差分析(ANOVA)進行數(shù)據(jù)處理，方差齊性時組間兩兩比較，采用LSD檢驗;方差不齊時采用Dunnett

7、's T3(3)檢驗;若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis單因素ANOVA(k樣本)(W);配對數(shù)據(jù)對比采用配對樣本T檢驗。
　　結果：
　　1.左、右歸丸對不同性別去勢大鼠腰椎BMD及骨丟失率的影響除T組外，其余各組大鼠給藥后腰椎BMD與去勢前相比均有明顯差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　相同性別大鼠給藥后腰椎BMD組間比較:模型組（OVX組、ORX組）較假手術組顯著降低;E2組、

8、雌性左歸丸組、雌性右歸丸組大鼠腰椎BMD均較OVX組顯著增高，但仍低于假手術組;與ORX組相比，T組、雄性右歸丸組大鼠腰椎BMD顯著增高，雄性左歸丸組則無顯著差異，但均低于假手術組。其中，雌性左歸丸組與雌性右歸丸組、雄性左歸丸組與雄性右歸丸組之間均存在明顯差異，且后者高于前者。
　　相同性別大鼠給藥后腰椎骨丟失率組間比較，結果顯示:模型組（OVX組、ORX組）大鼠腰椎骨丟失較假手術組顯著增加;E2組、雌性左歸丸組、雌性右歸丸組大鼠

9、腰椎骨丟失均較OVX組顯著減少，但仍明顯多于假手術組;與ORX組相比，T組、雄性右歸丸組大鼠腰椎骨丟失顯著減少，雄性左歸丸組則無顯著差異，但均仍多于假手術組。其中，雌性左歸丸組與雌性右歸丸組、雄性左歸丸組與雄性右歸丸組之間骨丟失率均存在明顯差異，且后者低于前者。
　　不同性別大鼠給藥后腰椎骨丟失率組間比較，結果顯示:雌性與雄性假手術組、OVX組與ORX組、雌性與雄性左歸丸組、雌性與雄性右歸丸組之間骨丟失均有顯著差異。其中OVX組骨

10、丟失明顯多于ORX組(P＜0.01)，雄性左歸丸組則明顯多于雌性左歸丸組（P＜0.05）、雄性右歸丸組則明顯多于雌性右歸丸組(P＜0.01)，但雌性假手術組骨量增加明顯低于雄性假手術組(P＜0.05)。
　　2.左、右歸丸對不同性別去勢大鼠骨組織形態(tài)計量學指標的影響
　　2.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨TBV％及骨丟失率的影響相同性別大鼠脛骨TBV％組間比較:模型組（OVX組、ORX組）較假手術組顯著降低;雄性左歸丸

11、組與ORX組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，其余各給藥組均較同性別模型組顯著升高，但仍明顯低于同性別假手術組。其中，雌性右歸丸組高于雌性左歸丸組，雄性右歸丸組高于雄性左歸丸組，且之間差異有統(tǒng)計學意義。
　　不同性別大鼠脛骨TBV％組間比較:雌性假手術組與雄性假手術組、OVX組與ORX組之間具有顯著差異，且均為后者高于前者。
　　相同性別大鼠脛骨骨丟失率組間比較，結果顯示:模型組（OVX組、ORX組）骨量丟失明顯多于假手術組

12、;雄性左歸丸組骨量丟失與ORX組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其余各給藥組均較同性別模型組骨量丟失顯著減少，但仍明顯多于同性別假手術組。其中，雌性右歸丸組骨量丟失明顯少于雌性左歸丸組(P＜0.01)，雄性右歸丸組明顯少于雄性左歸丸組(P＜0.05)。
　　不同性別大鼠脛骨骨丟失率組間比較，結果顯示:雌性與雄性假手術組、OVX組與ORX組、雌性與雄性左歸丸組、雌性與雄性右歸丸組之間骨量丟失均存在顯著差異。其中OVX組骨量丟失明顯

13、多于ORX組(P＜0.05)，雄性左歸丸組則明顯多于雌性左歸丸組(P＜0.05)、雄性右歸丸組則明顯多于雌性右歸丸組(P＜0.05)，但雌性假手術組骨量增加明顯低于雄性假手術組(P＜0.05)。
　　2.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨TRS％、TFS％及TRS/TFS比值的影響相同性別組間比較:模型組（OVX組、ORX組）大鼠脛骨TRS％、TFS％及TRS/TFS比值均較同性別假手術組明顯升高。各給藥組中，E2組、T組和雌性

14、右歸丸組上述參數(shù)均較同性別模型組顯著降低，且均與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;雌性左歸丸組大鼠脛骨上述參數(shù)也明顯低于OVX組，但仍高于雌性假手術組，且二者存在統(tǒng)計學差異;雄性左歸丸組大鼠脛骨上述參數(shù)與ORX組相比，無統(tǒng)計學差異;而雄性右歸丸組大鼠脛骨上述參數(shù)較ORX組明顯降低，但仍明顯高于雄性假手術組。兩種中藥治療組中，雌性右歸丸組與雌性左歸丸、雄性右歸丸組與雄性左歸丸組大鼠脛骨上述參數(shù)相比，均有統(tǒng)計學差異，且前者明顯低于后者。
　

15、　不同性別大鼠脛骨TRS％、TFS％及TRS/TFS比值組間比較，結果顯示:雌、雄性假手術組、模型組(OVX組和ORX組)、左歸丸組和右歸丸組之間上述參數(shù)均有統(tǒng)計學差異，其中，TFS％比較，雌性假手術組低于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸低于雄性左歸丸，雌性右歸丸低于雄性右歸丸;與之對應，TRS％比較，雌性假手術組高于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸低于雄性左歸丸，雌性右歸丸低于雄性右歸丸;TRS/TFS比值

16、比較，雌性假手術組高于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組。
　　2.3 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨OSW、MAR和mAR的影響相同性別組間比較:模型組（OVX組、ORX組）大鼠脛骨OSW、MAR和mAR與同性別假手術組相比，顯著增高。各給藥組中，與同性別模型組(OVX組、ORX組)相比，E2組、T組和雌性右歸丸組上述參數(shù)均顯著下降，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與

17、OVX組相比，雌性左歸丸組大鼠脛骨上述參數(shù)明顯降低，但仍明顯高于雌性假手術組;與ORX組相比，雄性左歸丸組大鼠脛骨上述參數(shù)與之無統(tǒng)計學差異，而雄性右歸丸組較之明顯下降，但仍明顯高于雄性假手術組;與同性別左歸丸組比較，雌性、雄性右歸丸組MAR和mAR均明顯降低，雄性右歸丸組OSW較雄性左歸丸組明顯降低，雌性右歸丸組OSW較雌性左歸丸組有降低趨勢(P=0.054)。
　　不同性別大鼠組間比較，結果顯示:模型組(OVX組和ORX組)、左

18、歸丸組和右歸丸組兩種性別之間上述參數(shù)均存在差異(P＜0.05或P＜0.01)。其中，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組。假手術組之間比較，OSW雌性較雄性無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但有降低趨勢;MAR和mAR則雌性顯著低于雄性(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL蛋白和mRNA表達以及RANKL/OPG和RANKLmRNA

19、/OPGmRNA比值的影響
　　3.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓OPG蛋白和mRNA表達的影響相同性別組間進行比較，結果顯示:與同性別假手術組相比，模型組(OVX組、ORX組)大鼠脛骨骨髓OPG蛋白和mRNA表達陽性密度均顯著降低;與同性別模型組（OVX組、ORX組）相比，E2組、T組和雌性右歸丸組陽性密度均顯著增高，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與OVX組相比，雌性左歸丸組陽性密度明顯升高，但仍明顯低于雌性假手術組

20、;與ORX組相比，雄性左、右歸丸組OPG蛋白和mRNA表達陽性密度與其均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　不同性別組間大鼠脛骨骨髓OPG蛋白和mRNA表達陽性密度進行比較，結果顯示:雌性假手術組低于雄性假手術組，OVX組低于ORX組，雌性左歸丸組高于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組高于雄性右歸丸組，且兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表達

21、的影響相同性別組間進行比較，結果顯示:與同性別假手術組相比，模型組(OVX組、ORX組)大鼠脛骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表達陽性密度均顯著升高;與同性別模型組（OVX組、ORX組）相比，E2組、T組和雌性右歸丸組陽性密度均顯著減低，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與OVX組相比，雌性左歸丸組陽性密度明顯減低，但仍明顯高于雌性假手術組;與ORX組相比，雄性左歸丸組陽性密度與其無統(tǒng)計學差異，而雄性右歸丸組較之明顯減低，但仍明顯高于雄性假

22、手術組。
　　不同性別組間大鼠脛骨骨髓RANKL蛋白和mRNA表達陽性密度進行比較，結果顯示:雌性假手術組高于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組，且兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.3 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值的影響相同性別組間進行比較，結果顯示:與同性別假手術組相比，

23、模型組(OVX組、ORX組)大鼠脛骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值均顯著升高;與同性別模型組（OVX組、ORX組）相比，E2組、T組和雌性右歸丸組陽性密度均顯著減低，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與OVX組相比，雌性左歸丸組陽性密度明顯減低，但仍明顯高于雌性假手術組;與ORX組相比，雄性左歸丸組陽性密度與其無統(tǒng)計學差異，而雄性右歸丸組較之明顯減低，但仍明顯高于雄性假手術組。
　　不同性別組間大鼠脛

24、骨骨髓RANKL/OPG和RANKLmRNA/OPGmRNA比值進行比較，結果顯示:雌性假手術組高于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組，且兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓中Wnt1、LRP-5及β-catenin蛋白和mRNA表達的影響
　　4.1 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓Wnt1蛋白和m

25、RNA表達的影響相同性別組間進行比較，結果顯示:與同性別假手術組相比，模型組(OVX組、ORX組)大鼠脛骨骨髓Wnt1蛋白和mRNA表達陽性密度均顯著增高;與同性別模型組（OVX組、ORX組）相比，E2組、T組和雌性右歸丸組陽性密度均顯著降低，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與OVX組相比，雌性左歸丸組陽性密度明顯減低，但仍明顯高于雌性假手術組;與ORX組相比，雄性左歸丸組陽性密度與其無統(tǒng)計學差異，而雄性右歸丸組較之明顯減低，但仍明顯高

26、于雄性假手術組。
　　不同性別組間大鼠脛骨骨髓Wnt1蛋白和mRNA表達陽性密度進行比較，結果顯示:雌性假手術組低于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組，且兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.2 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表達的影響相同性別組間進行比較，結果顯示:與同性別假手術組相比，模型組(OVX組、ORX

27、組)大鼠脛骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表達陽性密度均顯著升高;與同性別模型組（OVX組、ORX組）相比，E2組、T組和雌性右歸丸組陽性密度均顯著降低，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與OVX組相比，雌性左歸丸組陽性密度明顯降低，但仍明顯高于雌性假手術組;與ORX組相比，雄性左歸丸組陽性密度與其無統(tǒng)計學差異，而雄性右歸丸組較之明顯降低，但仍明顯高于雄性假手術組。
　　不同性別組間大鼠脛骨骨髓LRP-5蛋白和mRNA表達陽性密度進行

28、比較，結果顯示:雌性假手術組低于雄性假手術組，OVX組高于ORX組，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組，且兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4.3 左、右歸丸對不同性別去勢大鼠脛骨骨髓β-catenin蛋白和mRNA表達的影響相同性別組間進行比較，結果顯示:與同性別假手術組相比，模型組(OVX組、ORX組)大鼠脛骨骨髓β-catenin蛋白和mRNA表達陽性密度均顯著增高;與同性別模

29、型組（OVX組、ORX組）相比，E2組、T組和雌性右歸丸組陽性密度均顯著減低，且與同性別假手術組無統(tǒng)計學差異;與OVX組相比，雌性左歸丸組陽性密度明顯減少，但仍明顯高于雌性假手術組;與ORX組相比，雄性左歸丸組陽性密度與其無統(tǒng)計學差異，而雄性右歸丸組較之明顯減少，但仍明顯高于雄性假手術組。
　　不同性別組間大鼠脛骨骨髓β-catenin蛋白和mRNA表達陽性密度進行比較，結果顯示:雌性假手術組低于雄性假手術組，OVX組高于ORX組

30、，雌性左歸丸組低于雄性左歸丸組，雌性右歸丸組低于雄性右歸丸組，且兩者之間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　結論：
　　1.去勢均可導致同齡不同性別大鼠發(fā)生高轉換型骨質疏松癥，即骨吸收和骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，而使骨量丟失。所不同的是，OVX大鼠的骨轉換率顯著高于ORX大鼠，骨丟失率也明顯高于后者。OVX大鼠和ORX大鼠骨髓中RANKL表達均顯著上調，而OPG表達均顯著下調，兩者的比值(RANKL

31、/OPG)也均明顯增高，從而使破骨細胞的活性增強，骨吸收增加;同時，Wnt1、LRP-5和β-catenin表達均顯著上調，從而使成骨細胞的活性增強，骨形成增加。但由于破骨細胞活性增強的幅度大于成骨細胞活性增強的幅度，而導致骨質疏松癥的發(fā)生;去勢所致的雌性大鼠的上述改變明顯強于去勢的雄性大鼠。這是去勢均可導致雌、雄大鼠發(fā)生高轉換型骨質疏松癥，但雌性大鼠的骨轉換以及骨丟失率明顯高于雄性的機理之一。
　　2.左歸丸、右歸丸對不同性別去

32、勢大鼠骨質疏松癥的作用存在明顯差異:左歸丸對OVX大鼠骨質疏松癥具有明顯的療效，而對ORX大鼠骨質疏松癥沒有療效;右歸丸對OVX大鼠和ORX大鼠骨質疏松癥雖均有明顯的療效，但對OVX大鼠的療效要明顯優(yōu)于ORX大鼠。
　　3.左歸丸、右歸丸對不同性別去勢大鼠骨質疏松癥的作用產生差異的機制:(1)左歸丸產生差異的機制是，左歸丸能使OVX骨質疏松癥大鼠骨髓中RANKL表達顯著下調，而使OPG表達顯著上調;同時，使Wnt1、LRP-5和β

33、-catenin表達顯著下調;通過此作用，導致骨吸收與骨形成均降低，抑制骨的高轉換，使骨吸收與骨形成達到相對的平衡狀態(tài)，從而防止骨量的丟失。而左歸丸對ORX骨質疏松癥大鼠骨髓中的以上關鍵因子無明顯影響。(2)右歸丸產生差異的機制是，右歸丸對OVX骨質疏松癥大鼠骨髓中OPG、RANKL以及Wnt1、LRP-5和β-catenin的作用與左歸丸的相同，只是右歸丸的作用強度要明顯高于左歸丸。右歸丸能使ORX骨質疏松癥大鼠骨髓中RANKL以及W

34、nt1、LRP-5和β-catenin表達均顯著下調;但對OPG表達無明顯影響，并且對RANKL、Wnt1、LRP-5和β-catenin的作用要明顯弱于對OVX骨質疏松癥大鼠的作用，從而造成右歸丸對OVX骨質疏松癥大鼠骨的高轉換的抑制作用要明顯強于對ORX骨質疏松癥大鼠，進而導致其對前者骨質疏松癥的療效要明顯優(yōu)于后者。
　　4.以上結果表明，“腎主骨”存在性別差異，OPG/RANKL破骨細胞調控通路和Wnt/LRP-5/β-ca