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文檔簡介
1、透明質酸(HA)作為一種高分子量的黏多糖,廣泛存在于脊椎動物細胞中,發(fā)揮著結構、信號傳導和信號識別的功能。HA由于其優(yōu)異的黏彈性、保濕性和支撐作用,被廣泛的應用于醫(yī)藥、化妝品、藥物傳遞系統(tǒng)、疫苗和功能健康食品。目前,工業(yè)上主要經由革蘭氏陽性C型鏈球菌如獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)發(fā)酵生產。但作為生產菌株,鏈球菌生長速度慢、培養(yǎng)基成本高等劣勢日益顯現出來,而尋找新的優(yōu)秀野生生產菌株的希望渺茫。所以,利
2、用基因工程構建合成HA的工程菌株不但有利于克服鏈球菌作為發(fā)酵生產HA菌株的劣勢,而且對提高HA的品質,擴大HA的應用范圍具有理論意義和應用價值。 乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)作為革蘭氏陽性菌的模式生物,已被廣泛應用于食品發(fā)酵生產中,且被認定為GRAS微生物。乳酸乳球菌由于其自身的優(yōu)良特性,正越來越多地被應用于代謝工程改造過的現代工業(yè)中。在過去的25年中,乳酸乳球菌的基因操作方法日益成熟,其中一系列的誘導表達啟動
3、子得到了深入的研究,并已開始應用于工業(yè)生產。通過改變小肽、單糖的濃度或誘導溫度等調控因子,這些啟動子能夠實現乳酸乳球菌工程菌株中目的蛋白的可控表達。NICE系統(tǒng)是乳酸乳球菌中研究最深入和最有效的基因工程操作系統(tǒng)之一,已被廣泛地應用于該菌株的代謝工程改造。不但誘導劑乳酸鏈球菌素(nisin)是一種理想的高效安全無毒的食品級誘導分子,而且在NICE系統(tǒng)中可以將染色體上lacF基因缺失的乳酸球菌菌株以及含有l(wèi)acF基因的質粒結合使用,用食品級
4、篩選標記lacF替代抗生素抗性基因,構建食品級表達系統(tǒng),而且該方式構建的工程菌株遺傳穩(wěn)定。為了改善現有HA生產菌株的不足,計劃利用該系統(tǒng)構建既具有合成HA能力的,同時符合公認安全標準的乳酸乳球菌工程菌株。工程菌株NFHA03和NFHA02發(fā)酵液中HA的濃度分別為0.49 g/L和0.38g/L,前者大約高出后者33%。證明在乳酸乳球菌工程菌株中重組表達異源szHasA,同時超表達同源UDP-GlcDH和LACR較同時表達外源szHasA
5、、szHasB和szHasC更利于HA的合成。本論文利用lacF基因作為食品級篩選標記和NICE表達系統(tǒng),構建得到一株不產生莢膜的具有食品級HA合成能力的工程菌株,而食品級HA在保健食品、醫(yī)藥產品和化妝品的應用中具有明顯的優(yōu)勢。 HA的相對分子質量(Mr)一般分布在104 Da~107 Da范圍內。研究表明,在細胞和組織中,HA生物活性與糖鏈長度相關,不同Mr的HA具有不同甚至相反的生理或藥理作用,HA的多種生物活性具有Mr依
6、賴性。通過差異表達HA合成相關酶類,脊椎動物具有在體內調控HA Mr的能力。而目前微生物發(fā)酵生產的HA是Mr從大到小的一系列糖鏈的組合。因此,在活體微生物中確定HA的Mr調控機制并且建立制備特定Mr或特定Mr范圍分布的HA的方法,不但具有重要的理論意義,而且對擴展HA的應用范圍、改良含HA產品的質量具有應用價值。體外實驗已證明,合成能力與底物濃度的比率是影響HA Mr的主要因素之一,認為這一理論同樣適用于活體微生物內。為實現乳酸乳球菌工
7、程菌株中HA合成能力與底物濃度的比率的可控調節(jié),本論文構建了一個雙質粒的調控表達系統(tǒng),包括表達szllasA的載體pN28148-szHasA和表達szllasB的載體pN29531-szHasB,而這兩個質??晒泊嬗谕恢耆樗崛榍蚓?。pN28148-szHasA包含有乳酸乳球菌常用載體pSH71的復制起始位點,而szllasA基因位于NICE系統(tǒng)啟動子nisA的調控之下;而另一個載體pN29531-szHasB則含有另一個乳酸乳球菌
8、常用載體pAMb1所攜帶的復制起始位點,同時szllasB基因的誘導表達受到lacR啟動子的調控。蛋白表達結果證明在工程菌株NFHA04中,借助pN28148-szHasA和pN29531-szHasB組成的雙質粒調控表達系統(tǒng),實現了不同誘導條件下改變szHasA與szHasB之間表達水平比率的實驗目的。szHasA和szHasB mRNA拷貝數之間的比率,表征著HA合成能力與HA底物合成能力之間的相對強弱。不同誘導條件下,分析szHa
9、sA/szHasB mRNA比率對乳酸乳球菌工程菌株NFHA04合成HA的重均分子量(Mw)的影響,在微生物體內證明了HA合成能力與底物合成能力之間的相對強弱具有調控HA Mw的作用。當代表HAS和UDP-GlcDH之間相對強度的szHasA/szHasB mRNA比率高時,發(fā)酵液中HA的Mw相對較小,而當szHasA/szHasB mRNA比率減小時,Mw則變大。分析認為,合成HA能力與合成HA底物能力之間的相對強弱是影響微生物HA
10、Mr的重要因素之一,szHasA和szHasB mRNA拷貝數之間的比率高時,活細胞體內每一個HAS分子能夠分配到的用來合成HA的底物就相對較少,則每一個HAS分子能夠合成的HA糖鏈就相對較短,從而造成合成的HA的Mw就較??;而當這一比率降低時,每一個HAS分子就有相對較多的底物分子可以用來合成HA糖鏈,從而造成合成的HA的糖鏈較長,Mw也變大。這一理論的確定,為通過調節(jié)微生物體內HAS的表達水平和底物濃度來控制微生物生產過程中發(fā)酵液中
11、HA Mr特性提供了切實可行的解決方案,具有重大的理論意義和潛在應用價值。 本論文的主要內容: (1)通過NICE系統(tǒng),將獸疫鏈球菌HA合成代謝途徑相關基因導入乳酸乳球菌,構建一系列工程菌株。分析各工程菌株合成HA的濃度,證明利用代謝工程手段在乳酸乳球菌中引入編碼HAS的基因,可以該菌株獲得利用葡萄糖合成HA的能力。但自身合成的HA底物的不足限制HAS在工程菌株中合成高濃度的HA,而提高工程菌株HA底物的濃度,有助于HA合
12、成能力的提高。 (2)通過融合PCR方法得到一個重組HA合成操縱子,利用lacF基因作為食品級篩選標記和NICE表達系統(tǒng),將該重組HA合成操縱子導入乳酸乳球菌,實現在同一株工程菌株中重組表達異源szHasA,同時超表達同源UDP-GlcDH和LACR,表達這三個合成HA關鍵酶的乳酸乳球菌工程菌株具備了合成食品級HA的能力。 (3)構建了一個雙質粒的調控表達系統(tǒng),包括表達szllasA的載體pN28148-szHasA和表達s
13、zllasB的載體pN29531-szHasB中。在工程菌株NFHA04中實現了不同誘導條件下改變szHasA與szHasB之間表達水平比率的實驗目的。 (4)不同誘導條件下,分析szHasA/szHasB mRNA比率對乳酸乳球菌工程菌株NFHA04合成HA的重均分子量(Mw)的影響。證明合成HA能力與合成HA底物能力之間的相對強弱是影響微生物HA Mr的重要因素之一,szHasA和szHasB mRNA拷貝數之間的比率高時,活
14、細胞體內每一個HAS分子能夠分配到的用來合成HA的底物就相對較少,則每一個HAS分子能夠合成的HA糖鏈就相對較短,從而造成合成的HA的Mw就較小;而當這一比率降低時,每一個HAS分子就有相對較多的底物分子可以用來合成HA糖鏈,從而造成合成的HA的糖鏈較長,Mv也變大。 本論文主要創(chuàng)新點: (1)首次通過融合PCR方法得到重組HA合成操縱子。并首次在同一乳酸乳球菌工程菌株中實現了重組表達異源szHasA,同時超表達同源UDP
15、-GlcDH和LACR。 (2)首次利用lacF基因作為食品級篩選標記和NICE表達系統(tǒng),在乳酸乳球菌終建立了透明質酸合成途徑。該乳酸乳球菌工程菌株具備合成食品級HA的能力。 (3)首次在乳酸乳球菌工程菌株中實現了獸疫鏈球菌HAS與UDPGlcDH的同時誘導可控表達。 (4)首次在活體微生物體內證明HA合成能力與底物合成能力之間的相對強弱具有調控HA Mw的作用。這一理論的確定,為通過調節(jié)微生物體內HAS的表達水平和底
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