里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅱ基因的克隆與表達.pdf

1、纖維二糖水解酶是能夠高效降解木質(zhì)纖維素的里氏木霉纖維素酶的重要組分之一，是纖維素酶催化水解結(jié)晶區(qū)纖維素的關(guān)鍵。本文從里氏木霉（Trichoderma reesei）ZU-02中克隆出了cbh2基因，并研究其在大腸桿菌、畢赤酵母、里氏木霉中的表達。
　　采用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得里氏木霉cbh2基因，用其構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果表明:里氏木霉cbh2基因已在大腸桿菌中成功實現(xiàn)胞內(nèi)表達。
　　分別采用里氏木霉c

2、bh2基因和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的cbh2s基因構(gòu)建重組載體，并在畢赤酵母中進行表達。篩選獲得2株優(yōu)良轉(zhuǎn)化子，分別包含cbh2(PC-1)和cbh2s(PC-2)。發(fā)酵液SDS-PAGE結(jié)果顯示在約58 kDa處有單一明顯條帶，為重組CBHⅡ，即cbh2基因在畢赤酵母中的表達產(chǎn)物，其中包含了約5 kDa的糖基化。
　　對轉(zhuǎn)化子PC-1和PC-2的產(chǎn)酶性能進行了比較實驗，誘導(dǎo)發(fā)酵96 h，PC-2的纖維二糖水解酶活力是PC-1的2.02倍

3、，PC-2的可溶性蛋白是PC-1的1.66倍。研究結(jié)果表明:密碼子優(yōu)化策略促進了里氏木霉cbh2基因在畢赤酵母中的異源表達。
　　研究了重組畢赤酵母所產(chǎn)CBHⅡ的最適pH與最適溫度，分別是5.0和50℃。模擬了CBHⅡ的CBD和CD區(qū)域的三維模型。
　　為了提高里氏木霉纖維素酶的協(xié)同降解能力，將cbh2基因置于里氏木霉的強啟動子Pcbh1及其信號肽下游，并進一步以pCAMBIA1300為載體骨架，構(gòu)建成含潮霉素B抗性標記的重

4、組質(zhì)粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉宿主細胞。優(yōu)化了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)里氏木霉轉(zhuǎn)化的諸因素，使得轉(zhuǎn)化率大幅提高。針對篩選里氏木霉高產(chǎn)纖維二糖水解酶轉(zhuǎn)化子的特殊要求，采用潮霉素抗性篩選與菌落在微晶纖維素平板上的生長速率篩選相結(jié)合的兩步法篩選，從326個里氏木霉轉(zhuǎn)化子中篩選出10個優(yōu)良轉(zhuǎn)化子。
　　對重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子(C10)的產(chǎn)酶性能進行了研究，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和產(chǎn)酶條件。

5、搖瓶條件下發(fā)酵120 h，重組里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶活力和纖維二糖酶活力與初始菌株相比沒有明顯變化，但其纖維二糖水解酶活力為122.44U/mL，是初始菌株的5.4倍。由于重組里氏木霉纖維素酶系組成中纖維二糖水解酶活力明顯提高，其纖維素酶總活力（濾紙酶活力）也提高到初始菌株的4.3倍。
　　對重組纖維素酶在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用性能進行了研究。以初始菌株ZU-02纖維素酶為參照，在同等條件下，重組纖維素酶對玉米秸稈的酶解得率高達9