SIRT1通路在大鼠腦出血繼發(fā)性線粒體功能障礙及神經(jīng)細胞凋亡中的保護作用及機制研究.pdf

1、背景：腦出血（(intracerebralhemorrhage,ICH)是中老年人常見的急性腦血管疾病，具有高病死率和高致殘率，是我國腦血管疾病中死亡率最高的臨床類型。雖歷經(jīng)多年研究，但至今發(fā)病機制不甚清楚，治療手段有限。近年來研究表明，血腫周圍帶能量代謝障礙在腦出血繼發(fā)性損傷中起著重要的作用。腦出血后能量代謝原料的供應中斷，引起能量代謝障礙能量物質(zhì)匱乏，啟動腦出血后的損傷級聯(lián)反應。線粒體作為細胞有氧呼吸和能量供應的場所，其結構和功能受

2、損與腦出血所引起的能量代謝障礙密切相關，同時線粒體功能障礙可啟動線粒體凋亡途徑誘導的細胞凋亡。由此可見線粒體功能障礙及其誘導的細胞凋亡可能是腦出血的重要致病機制，也有望成為治療腦出血的重要靶點。越來越多研究顯示，Silent information regulator1(SIRT1)參與體內(nèi)線粒體功能障礙的修復，并在多種神經(jīng)退行性疾病中具有一定的神經(jīng)保護作用。然而SIRT1在大鼠腦出血繼發(fā)性損傷的保護作用及其可能的調(diào)控機制目前尚不清楚。

3、
　　目的：探討SIRT1在大鼠腦出血繼發(fā)性損傷中的神經(jīng)保護作用及其可能的相關調(diào)控機制。
　　方法：
　?。?）構建大鼠腦出血模型，于建模后腹腔注射SIRT1激動劑SRT17205mg/kg/d直至建模后48h。觀察激動SIRT1對大鼠腦出血后神經(jīng)學功能、腦水腫含量、形態(tài)學的影響，并通過電子顯微鏡對血腫周圍線粒體形態(tài)學的觀察、線粒體ATP和線粒體DNA的測定評價激動SIRT1對大鼠腦出后繼發(fā)性線粒體功能障礙的神經(jīng)保護作

4、用。采用real-time qPCR和Western Blot檢查SIRT1在大鼠腦出血后核內(nèi)及總蛋白的表達情況。同時通過Western Blot檢測AMPK及p-AMPK的表達情況。
　?。?）于構建大鼠腦出血模型后激動SIRT1，采用Western Blot檢測PGC-1α核內(nèi)及總蛋白表達水平，線粒體電子傳遞鏈相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達水平。同時采用免疫共沉淀(IP)檢測乙?；疨GC-1α的表達水平。
　?。?）構建一

5、條化學合成的陰性對照siRNA和三條PGC-1αsiRNA，建立大鼠腦出血模型，建模前24小時行側腦室注射siRNA，同時于建模后腹腔注射SRT1720。采用real-time qPCR和Western Blot檢測PGC-1α siRNA干擾片段的干擾效率，并選出最有效的PGC-1αsiRNA干擾片段。檢測PGC-1α基因干擾后線粒體電子傳遞鏈相關蛋白及線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達情況。
　?。?）構建一條化學合成陰性對照siR

6、NA和三條SIRT1 siRNA，建立大鼠腦出血模型，建模前24小時行側腦室注射siRNA。采用real-time qPCR和Western Blot檢測SIRT1 siRNA干擾片段的干擾效率，并選出最有效的SIRT1 siRNA干擾片段。觀察SIRT1基因干擾后對大鼠腦出血后神經(jīng)學功能、腦水腫含量、形態(tài)學的影響。通過電子顯微鏡檢測血腫周圍線粒體形態(tài)變化，同時測定線粒體ATP和線粒體DNA含量。Western Blot檢測PGC-1α

7、、線粒體電子傳遞鏈相關蛋白及線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達。
　　結果：
　　（1）激動SIRT1明顯緩解大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺失，減少大鼠腦含水量，減少神經(jīng)細胞損傷,緩解線粒體水腫，增加線粒體ATP含量及線粒體DNA含量。激動SIRT1可引起SIRT1總蛋白、SIRT1核內(nèi)蛋白及mRNA表達增加。誘導PGC-1α、去乙酰化PGC-1α及線粒體電子傳遞鏈相關蛋白表達增高，而凋亡途徑相關蛋白表達降低。
　?。?）干擾PGC

8、-1α可抑制由SRT1720誘導的PGC-1α及線粒體電子傳遞鏈相關蛋白表達增高，同時引起線粒體凋亡途徑相關蛋白表達進一步增高。
　?。?）干擾SIRT1促進大鼠腦出血后神經(jīng)功能缺失，增加大鼠腦含水量，增加神經(jīng)細胞損傷,增加線粒體水腫，減少線粒體ATP含量及線粒體DNA含量。同時減少SIRT1蛋白及mRNA表達水平，抑制PGC-1α及線粒體電子傳遞鏈相關蛋白表達增高，增加凋亡途徑相關蛋白表達。
　　結論：SIRT1通過恢復提