雌激素上調錯配修復基因MLH1抑制結腸癌細胞增殖的研究.pdf

1、目的：
　　人DNA錯配修復(mismatch repair, MMR)系統(tǒng)在維持基因組穩(wěn)定性中起著關鍵作用。MMR功能障礙導致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability, MSI）與許多惡性腫瘤的發(fā)生有密切關系，例如Lynch綜合征。此外，約15％的散發(fā)性結直腸癌(colorectalcancer, CRC)也與MMR功能障礙相關。流行病學調查數(shù)據(jù)證實雌激素替代治療對結直腸癌患者具有保護性作用。我們的前

2、期研究表明，雌激素的這一作用可能與DNA錯配修復蛋白MLH1有關。MLH1是體內最重要的MMR基因之一。然而，雌激素如何調節(jié)錯配修復基因MLH1表達的具體機制尚不清楚。本研究旨在探討雌激素誘導MLH1表達的機制，以及通過雌激素信號通路途徑誘導MLH1表達對結直腸腫瘤增殖的影響。
　　第一部分 雌激素誘導MLH1表達的機制研究
　　我們的前期研究結果表明，圍絕經(jīng)期女性的結腸上皮細胞內源性MLH1蛋白表達水平與體內血清雌激素濃度

3、呈正相關關系，但其MSH2蛋白表達與血清雌激素濃度無明顯相關性。并且，體外研究發(fā)現(xiàn)雌激素可增強結腸上皮細胞內MLH1表達水平，但對MSH2蛋白表達影響非常有限。本研究旨在探討雌激素誘導MLH1表達的作用機制。
　　方法：
　　1.在SW480、HT29和LoVo細胞中過表達雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)，經(jīng)由雌二醇(E2)或者牛血清結合的雌二醇(BSA-E2)處理，利用實時定量聚合酶鏈反應(real-time

4、 quantitative Polymerase Chain Reaction，RT Q-PCR)及蛋白質免疫印跡(Western Blot)方法從mRNA和蛋白質的水平分別檢測MLH1的表達情況。
　　2.根據(jù)UCSC(www.geome.ucsc.edu)在線數(shù)據(jù)庫分析MLH1基因轉錄起始位點，然后利用PCR方法從人基因組DNA中克隆MLH1基因近端啟動子（-1953/+53），并插入到雙熒光報告基因載體pGL3-Basic中

5、，并命名為pGL3-Promoter-luc。然后運用熒光報告基因和染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)的方法檢測MLH1基因啟動子序列中是否存在雌激素應答元件。
　　結果：
　　1.E2在mRNA水平顯著增強三種結腸癌細胞株的MLH1基因表達，但與之相比較，BSA-E2對該基因的表達影響非常微弱。此外，雌激素處理細胞的情況下，與對照組相比，過表達ERβ對MLH1在mRNA

6、水平的表達上調具有協(xié)同作用(P＜0.001)。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)MLH1近端啟動子序列存在雌激素相關作用位點。并且，半雌激素應答元件與AP1結合位點在雌激素誘導MLH1表達的調控過程中都非常重要。
　　結論：
　　E2誘導MLH1表達是由ERβ介導，通過激活轉錄過程實現(xiàn)的。
　　第二部分 ERβ在體外和體內發(fā)揮抑制結直腸腫瘤生長的作用
　　據(jù)報道，ERβ特異性激動劑在體外和體內具有抑制增殖與誘導凋亡的作用。

7、另一方面，絕經(jīng)后雌激素替代治療降低了微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定及微衛(wèi)星穩(wěn)定型的結直腸癌發(fā)病風險。本研究旨在明確ERβ介導的MLH1表達上調是否能在體外和體內抑制結直腸癌細胞生長。
　　方法：
　　1.siRNA-shMLH1表達質粒轉染SW480和Caco2細胞，同時伴隨或不伴隨ERβ過表達，然后分別與溶劑、雌激素或雌激素加ERβ特異性拮抗劑PHTPP孵育，并用5-FU處理細胞。最后用細胞計數(shù)試劑盒CCK-8檢測細胞活性。
　　

8、2.實驗動物行雙側卵巢切除術，然后采用AOM/DSS誘導小鼠結直腸癌，并將實驗動物分為2組，每5只一組。各組實驗動物分別接受DPN（1 mg/kg/日）和等體積溶劑皮下注射。16周后采用頸椎離斷法處死動物，取結直腸，稱重并測量長度，計算重量/長度比值。
　　3.將HT29細胞(5×106)注射到已切除雙側卵巢的裸鼠皮下，并將實驗動物分為3個組，每5只一組。各組實驗動物分別接受DPN（1 mg/kg/日）、PHTPP（10-7 mo

9、l/日）和等體積溶劑皮下注射。使用以下公式對移植瘤體積進行監(jiān)測:體積=1/2×（最大直徑）×（最小直徑）2。最終取部分移植瘤組織進行蛋白免疫印跡檢測。
　　結果：
　　1.當細胞內源性MLH1蛋白表達被抑制，5-FU處理后細胞活性未顯著降低。然而，過表達ERβ加E2處理，上調MLH1表達水平，從而增強細胞對5-FU的敏感性，細胞活性顯著下降。
　　2.與溶劑注射組相比，DPN注射組的成瘤數(shù)量更少，結直腸平均重量/長度比