無(wú)創(chuàng)性軸向載荷建立兔腰椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型及其退變機(jī)制探索.pdf

1、椎間盤(pán)退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是一個(gè)多因素導(dǎo)致的病理過(guò)程，其典型表現(xiàn)為髓核組織脫水、蛋白多糖缺失、細(xì)胞數(shù)量減少、纖維環(huán)排列紊亂及破裂等，是椎間盤(pán)突出癥的主要病理基礎(chǔ)，也是許多脊柱退行性疾病的使動(dòng)原因。目前對(duì)椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制以及病理生理方面的認(rèn)識(shí)仍較為缺乏。椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型在闡明其發(fā)病機(jī)制以及評(píng)估新的治療方法方面發(fā)揮了重要作用，然而，當(dāng)前還沒(méi)有理想的椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型用以模擬人

2、類(lèi)椎間盤(pán)退變。人類(lèi)脊柱解剖結(jié)構(gòu)和肌肉系統(tǒng)在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化后與四足動(dòng)物形成了巨大差別，作用于脊柱的應(yīng)力類(lèi)型和強(qiáng)度均與四足動(dòng)物不同。人類(lèi)所特有的直立體位和直立體位下的應(yīng)力刺激也被認(rèn)為與脊柱相關(guān)疾病的高發(fā)生率相關(guān)。
　　本研究以兔為研究對(duì)象，通過(guò)無(wú)創(chuàng)性脊柱軸向加壓的方法建立一種新型椎間盤(pán)退變體內(nèi)動(dòng)物模型。這種造模方式能夠更好的模擬人類(lèi)椎間盤(pán)早期退變的自然進(jìn)程，從而為椎間盤(pán)退變研究提供更加合理的動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)該模型退變進(jìn)程的長(zhǎng)

3、時(shí)間實(shí)驗(yàn)觀(guān)察，從分子生物學(xué)和病理學(xué)方面深入探索椎間盤(pán)退變的相關(guān)機(jī)理。
　　第一部分無(wú)創(chuàng)性軸向積累性載荷建立兔腰椎間盤(pán)退變動(dòng)物模型
　　目的：通過(guò)直立體位下無(wú)創(chuàng)性軸向加載的方式，建立一種新型兔腰椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型，使之更好的模擬人類(lèi)腰椎間盤(pán)退變。
　　方法：24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組12只動(dòng)物。將實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物置于特制的透明塑料桶內(nèi)使之保持直立體位，并通過(guò)特制的頸圈使之負(fù)重600g，每日實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間為6

4、h。對(duì)照組動(dòng)物不接受任何處理而常規(guī)飼養(yǎng)。通過(guò)特制裝置測(cè)量實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在筒內(nèi)直立體位時(shí)與筒壁間的摩擦力。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后4周、8周12周對(duì)全部動(dòng)物行X線(xiàn)及核磁共振（MRI）檢查，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在筒內(nèi)時(shí)腰椎的骨性結(jié)構(gòu)，比較2組動(dòng)物腰椎間隙高度改變以及髓核含水量變化。實(shí)驗(yàn)干預(yù)12周后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物不再接受載荷刺激，同對(duì)照組一樣常規(guī)飼養(yǎng)2周，以恢復(fù)因壓力導(dǎo)致的椎間盤(pán)水合改變，14周時(shí)行末次MRI檢查。而后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組全部動(dòng)物處死，取L4-5

5、節(jié)段椎間盤(pán)髓核標(biāo)本，通過(guò)realtime-PCR檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)基因I型膠原、II型膠原及蛋白多糖表達(dá)水平；取L6-7節(jié)段椎間盤(pán)行正中矢狀面病理切片，通過(guò)HE及天狼星紅染色觀(guān)察各組動(dòng)物椎間盤(pán)內(nèi)組織病理學(xué)改變。
　　結(jié)果：2只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至3周及7周時(shí)死亡，其相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從結(jié)果中剔除。實(shí)驗(yàn)組剩余的10只動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)處理耐受良好。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物與筒壁間相對(duì)摩擦力測(cè)量顯示，開(kāi)始時(shí)摩擦力占體重的19％，隨時(shí)間逐漸下降，到20min時(shí)

6、，摩擦力降至11.1%，在此后的40min測(cè)量時(shí)間內(nèi)均在該水平波動(dòng)。腰椎X線(xiàn)片顯示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物在直立體位負(fù)重條件下腰椎形成明顯后凸，較側(cè)臥體位下腰椎間隙明顯變窄。在L2-3節(jié)段，直立體位下DHI為側(cè)臥位時(shí)的74.4%；在L4-5節(jié)段為60.7%；在L6-7節(jié)段為46.5%。各節(jié)段間DHI改變幅度也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。椎間盤(pán)高度指數(shù)（disc height index,DHI）測(cè)量顯示2組動(dòng)物腰椎各節(jié)段DHI隨時(shí)間逐漸變小，但2

7、組間在任何時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異。MRI檢查顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組髓核相對(duì)灰度值均隨時(shí)間進(jìn)行性下降；在 L2-3節(jié)段，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組髓核灰度值在任何時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在L4-5節(jié)段，2組間髓核灰度值在12周時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在2周的恢復(fù)期后，2組間仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；在L6-7節(jié)段，2組間髓核灰度值在8周時(shí)即開(kāi)始有顯著性差異，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（P<0.05）。髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組I型膠原mRNA表

8、達(dá)明顯高于對(duì)照組（3.57倍，P<0.05）;而II型膠原及蛋白多糖表達(dá)明顯低于對(duì)照組（分別為0.35倍和0.43倍，P<0.05）。
　　病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組椎間盤(pán)組織結(jié)構(gòu)存在顯著差異：對(duì)照組 HE染色顯示髓核組織與纖維環(huán)間邊界清晰，髓核內(nèi)富含均勻分布的髓核細(xì)胞；天狼星紅染色顯示纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整無(wú)損壞，纖維環(huán)與髓核間界限清晰，在髓核區(qū)域無(wú)明顯膠原纖維長(zhǎng)入。實(shí)驗(yàn)組 HE染色顯示內(nèi)層纖維環(huán)明顯增生，而髓核區(qū)域相應(yīng)減小，增生的大

9、量纖維環(huán)樣組織源于軟骨終板，呈纖維軟骨樣外觀(guān)；而外層纖維環(huán)則喪失了其完整的層狀結(jié)構(gòu)；天狼星紅染色顯示實(shí)驗(yàn)組新生的雙折光膠原纖維起自軟骨終板，侵入髓核組織內(nèi)，增厚的后纖維環(huán)喪失了纖維環(huán)的正常層狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出雜亂的組織結(jié)構(gòu)。正中矢狀位切面上“功能性”髓核及纖維環(huán)寬度測(cè)量結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組前纖維環(huán)與后纖維環(huán)寬度較對(duì)照組分別增加了26.5%和37.6%；而髓核寬度較對(duì)照組減少14.5%。各組間比較均有顯著性差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：

10、本研究中直立體位下無(wú)創(chuàng)性軸向加載方式可顯著加速兔腰椎間盤(pán)的退變進(jìn)程，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物中、下段腰椎MRI影像中髓核含水量較對(duì)照組降低；實(shí)驗(yàn)組I型膠原表達(dá)升高，而II性膠原及蛋白多糖較對(duì)照組表達(dá)降低；實(shí)驗(yàn)組髓核組織內(nèi)大量纖維軟骨樣組織長(zhǎng)入，纖維環(huán)增厚，而髓核區(qū)域較對(duì)照組變小，均為典型的椎間盤(pán)退變?cè)缙谡飨蟆１狙芯拷⒌耐米甸g盤(pán)退變模型在發(fā)病機(jī)理上與人類(lèi)椎間盤(pán)退變更加相似，有望為該領(lǐng)域的研究提供更為合理的動(dòng)物模型。
　　第二部分積累性軸向

11、載荷致兔腰椎間盤(pán)退變的過(guò)程觀(guān)察及機(jī)制探索
　　目的：以軸向應(yīng)力致兔腰椎間盤(pán)退變體內(nèi)模型為研究對(duì)象，探索長(zhǎng)期軸向載荷刺激下椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程以及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：20只4月齡新西蘭兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=12）和對(duì)照組（n=8），實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物按照第一部分直立體位下軸向載荷體內(nèi)造模方法建立兔腰椎間盤(pán)退變模型，8只對(duì)照組動(dòng)物同期常規(guī)飼養(yǎng)，另設(shè)4只24月老齡兔同期飼養(yǎng)用于與年齡相關(guān)性退變比較。于造模前及造模開(kāi)始后6周、12周及24

12、周行MRI檢查，觀(guān)察各組椎間盤(pán)水合狀態(tài)，分析椎間盤(pán)退變進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別于造模后12周及24周取材，老齡組于24周后取材，對(duì)L5-6節(jié)段髓核組織行real-time PCR檢測(cè)，比較各組動(dòng)物髓核組織基質(zhì)基因I型膠原、II型膠原、蛋白多糖以及合成/分解代謝相關(guān)基因BMP-7、MMP-3、TIMP-1的表達(dá)水平；對(duì)取材標(biāo)本L6-7節(jié)段行正中矢狀位組織病理學(xué)切片，HE、天狼星紅染色觀(guān)察退變椎間盤(pán)的病理學(xué)改變。綜合評(píng)估長(zhǎng)期積累性軸向載荷導(dǎo)

13、致椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)生的組織結(jié)構(gòu)以及分子生物學(xué)改變。
　　結(jié)果：3只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至6周、9周及20周時(shí)死亡，其相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)從結(jié)果中剔除。實(shí)驗(yàn)組剩余的9只動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)處理耐受良好。MRI結(jié)果顯示在上腰椎（L2-3節(jié)段），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物腰椎髓核組織信號(hào)強(qiáng)度在24周觀(guān)察期內(nèi)均未見(jiàn)顯著改變，仍保持較高的含水量。在中段腰椎及下腰椎（L4-5及 L6-7節(jié)段），對(duì)照組24周觀(guān)察期內(nèi)仍未見(jiàn)顯著信號(hào)改變；而實(shí)驗(yàn)組從12周即可見(jiàn)明顯

14、信號(hào)減低，24周時(shí)改變更為明顯。老齡組上、中、下段腰椎間盤(pán)信號(hào)均較低，24周后信號(hào)改變不明顯。Realtime-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組髓核組織I型膠原mRNA表達(dá)較對(duì)照組和老齡組明顯增加，而 II型膠原及蛋白多糖表達(dá)較對(duì)照組和老齡組明顯減少；實(shí)驗(yàn)組合成代謝相關(guān)基因BMP-7及分解代謝相關(guān)基因MMP-3表達(dá)較對(duì)照組和老齡組均明顯升高，而組織金屬蛋白酶抑制因子 TIMP-1表達(dá)較對(duì)照組和老齡組明顯降低。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組12周病理結(jié)果顯示纖

15、維軟骨樣組織自終板長(zhǎng)入髓核組織，后纖維環(huán)增厚，髓核區(qū)域被分隔；24周時(shí)上述病理改變更為明顯，長(zhǎng)入髓核組織內(nèi)的纖維軟骨樣組織已分化為成熟纖維環(huán)結(jié)構(gòu)，髓核組織區(qū)域進(jìn)一步減少；30月齡兔椎間盤(pán)病理改變表現(xiàn)為整個(gè)髓核組織發(fā)生纖維化，髓核區(qū)域內(nèi)無(wú)明顯膠凍樣組織結(jié)構(gòu)，但纖維環(huán)排列則較為規(guī)整。髓核脊索細(xì)胞 CK18免疫組化染色顯示對(duì)照組髓核組織內(nèi)廣泛分布成簇存在的脊索細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)組髓核內(nèi)脊索細(xì)胞特異性抗原 CK18陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞簇較對(duì)照組明顯減少，髓核

16、組織中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)較多的單個(gè)存在的小軟骨細(xì)胞樣髓核細(xì)胞，而外周區(qū)域髓核組織則被上下軟骨終板發(fā)出的纖維軟骨樣組織取代。
　　結(jié)論：本研究采用的軸向載荷的長(zhǎng)期作用可使兔腰椎間盤(pán)發(fā)生進(jìn)行性退變，尤其在下腰椎，實(shí)驗(yàn)組24周載荷作用后，其腰椎間盤(pán)水合狀態(tài)與30月齡老齡兔相應(yīng)節(jié)段相當(dāng)。髓核基質(zhì)成分基因表達(dá)水平隨年齡變化較小，但對(duì)機(jī)械載荷刺激非常敏感。腰椎在高載荷作用下，其髓核內(nèi)合成及分解代謝均較為活躍，這可能是椎間盤(pán)內(nèi)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變的分子生物

17、學(xué)基礎(chǔ)。長(zhǎng)期軸向載荷作用會(huì)導(dǎo)致腰椎上、下軟骨終板產(chǎn)生大量纖維軟骨樣組織長(zhǎng)入髓核，將髓核組織分隔并逐步取代，形成成熟的纖維環(huán)樣結(jié)構(gòu)，然而后纖維環(huán)自身完整的層狀結(jié)構(gòu)喪失，并有髓核組織滲入后纖維環(huán)外層，成為椎間盤(pán)突出的病理基礎(chǔ)；老齡組椎間盤(pán)內(nèi)膠凍狀髓核組織亦顯著變小，但纖維環(huán)的層狀結(jié)構(gòu)正常。軸向載荷刺激可導(dǎo)致髓核內(nèi)脊索細(xì)胞特異性抗原CK18陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞簇較對(duì)照組明顯減少，髓核組織中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)較多的單個(gè)存在的小軟骨細(xì)胞樣髓核細(xì)胞，而外周區(qū)域髓核