產超廣譜β-內酰胺酶銅綠假單胞菌的流行及耐藥分子機制分析.pdf

1、研究背景：
　　銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，也是全球非常重要的醫(yī)院感染病原菌，據統(tǒng)計，人類感染的非發(fā)酵菌中，60％為銅綠假單胞菌感染。近年來，銅綠假單胞菌感染的持續(xù)高發(fā)，耐藥情況的日趨嚴峻，部分抗生素耐藥率的逐年上升，以及多重耐藥和泛耐藥的日益常見，均給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。有關銅綠假單胞菌耐藥機制的研究成為眾多學者關注的熱點，同時，因其耐藥機制極其復雜，也成為當今研究的難點。
　　超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)

2、是β-內酰胺酶中的一種，是一類可水解氧亞胺基β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺酶，能導致對第三代頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和單環(huán)類抗生素如氨曲南，甚至第四代頭孢菌素如頭孢吡肟和頭孢匹羅的耐藥。ESBLs在銅綠假單胞菌中的檢出率越來越高，已經成為銅綠假單胞菌β-內酰胺類抗生素臨床治療效果下降的最主要原因之一。但是，一直以來銅綠假單胞菌的ESBLs檢測存在爭議，尚無標準、高效的檢測方法，有關銅綠假單胞菌ESBLs攜帶情況、基因型別、

3、流行情況等等尚缺乏詳盡的數據。
　　隨著分子生物學技術、信息技術的發(fā)展，高通量測序技術應運而生。高通量測序技術，又稱為下一代測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短為特點。高通量測序技術使人類獲取基因組信息的方式發(fā)生了重大的變革，尤其適用于基因組較小的微生物領域的研究，已成為微生物鑒定分型、毒力分析、傳播途徑、耐藥機制等方面研究的重要工具。
　　本研究采用臨床實驗室標準化協會推薦的ESBL

4、s表型確證試驗，對本院可疑ESBLs陽性銅綠假單胞菌進行篩選，以多重 PCR方法對篩選陽性的結果進行耐藥基因的檢測，以了解我院銅綠假單胞菌ESBLs流行情況，并探討銅綠假單胞菌的ESBLs不同檢測方法間的優(yōu)劣；然后，通過高通量測序技術實現對其中一株多重耐藥菌株的全基因組測序，通過生物信息學分析，展開對銅綠假單胞菌的耐藥機制、耐藥基因環(huán)境等的研究。
　　研究目的：
　　了解廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌的耐藥性

5、及其超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的流行分布情況，深入分析銅綠假單胞菌的耐藥基因環(huán)境，探討其耐藥的分子機制。
　　研究方法：
　　1、收集2011年1月至2012年6月廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院微生物室分離出的銅綠假單胞菌，所有菌株用VITEK2微生物全自動鑒定儀進行鑒定和藥敏實驗，篩選頭孢他啶耐藥（MIC≥16ug/ml）的銅綠假單胞菌株，即可疑產ESBLs菌株，并對患者特點、病區(qū)分布、標本類型、藥敏結果等資料進行統(tǒng)計，分

6、析其流行病學特點。
　　2、采用表型確證試驗篩選產超廣譜β-內酰胺酶的菌株，并對表型試驗陽性菌株和表型試驗陰性菌株的耐藥率、多重耐藥、泛耐藥等情況進行統(tǒng)計學分析比較。
　　3、采用多重 PCR技術對表型試驗陽性菌株進行相關耐藥基因檢測，了解本院銅綠假單胞菌 ESBLs的主要基因型別，并探討銅綠假單胞菌 ESBLs不同檢測方法的優(yōu)劣。
　　4、用細菌 DNA純化試劑盒提取多重耐藥菌株 PA902的總 DNA，并用Illu

7、mina Miseq高通量測序儀進行測序。用Edena軟件進行數據拼接，RAST網上工具進行基因注釋，ResFinder和NCBI BLAST網上工具進行耐藥基因分析， NCBI BLAST網上工具進行耐藥基因遺傳環(huán)境分析，PlasmidFinder網上工具進行質粒序列分析，MLST網上工具進行MLST分析。
　　研究結果：
　　1、111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌的流行病學分析和藥敏結果分析2011年1月至2012年6月

8、廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院微生物室共分離出111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌。這些菌株分別來自于痰液63.9%（71/111）、胸水7.2%（8/111）、傷口分泌物7.2%（8/111）、尿液5.4%（6/111）、腹水4.5%（5/111）、血液3.6%（4/111）、其它標本類型5.4%（6/111）。患者年齡分布為：≥80歲20.7%（23/111）、70-79歲26.1%（29/111）、60-69歲13.5%（15/111）、

9、50-59歲18.9%（21/111）、其它年齡20.7%（23/111）。患者病區(qū)分布為：重癥醫(yī)學科37.8%（42/111）、內科綜合病區(qū)11.7%（13/111）、胸外科病區(qū)9.9%（11/111）、呼吸內科病區(qū)9.9%（11/111）、其它外科病區(qū)15.3%（17/111）、其它內科病區(qū)9.0%（10/111）、兒科0.9%（1/111）、外院5.4%（6/111）。111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌對11種抗生素的不敏感率如下

10、：哌拉西林94.4%、哌拉西林-他唑巴坦90.8%、頭孢吡肟81.1%、氨曲南91.9%、美羅培南72.7%、亞胺培南73%、慶大霉素55.9%、妥布霉素41.4%、阿米卡星31.5%、環(huán)丙沙星73%、左旋氧氟沙星66.7%。
　　2、ESBLs表型確證試驗結果分析111株頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌中超廣譜β-內酰胺酶表型確證試驗陽性菌株共23株，陽性率為20.7％；23株表型試驗陽性菌株的藥敏結果顯示除阿米卡星外，對其它10種抗

11、生素均呈現很高的耐藥率；經SPSS17.0統(tǒng)計軟件的 X2檢驗，23株產酶株對頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星幾種藥物的耐藥率顯著高于88株非產酶株的耐藥率，對哌拉西林、氨曲南、美羅培蘭、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南耐藥率均較高，無統(tǒng)計學差異；產酶株與非產酶株的多重耐藥、泛耐藥菌株比率經X2檢驗，結果顯示產酶株的泛耐藥菌株和全耐藥菌株比率顯著高于非產酶株。
　　3、多重PCR檢測ESBLs基因結果分析

12、用多重PCR對23株表型試驗陽性菌株進行檢測，發(fā)現20株ESBLs基因檢測陽性，其中19株為PER型，5株為TEM型，4株同時攜帶PER型和TEM型耐藥基因，未檢測出其它型別的ESBLs耐藥基因。
　　4、選取了一株多重耐藥銅綠假單胞菌PA902，PCR法證實該菌株攜帶PER型ESBLs基因，對其進行高通量測序，共得到5,061,082條reads，預測基因組覆蓋深度為198倍。通過數據過濾和拼接，共獲得2693條contigs，

13、最長contig長為60,157 bp，N50為19,105 bp，平均contig長度為2915 bp，GC含量為62.5%。
　　5、對拼接后的數據研究發(fā)現，編碼β-內酰胺酶的耐藥基因有3個，包括blaOXA-10, blaPER-1和blaVIM-2，氨基糖苷類耐藥基因發(fā)現了4個，分別為aph(3')-IId, aac(6')-Ib-cr, aacA4和aadA2，磺胺類耐藥基因有1個，為sul1，四環(huán)素耐藥基因有1個，為t

14、etG；氯霉素耐藥基因有1個，為floR。對染色體上的耐藥基因研究發(fā)現，染色體攜帶突變的gyrA和parC基因，與喹諾酮耐藥密切相關，另外還發(fā)現了多個與藥物外排相關的耐藥基因。
　　6、對攜帶耐藥基因的 contigs進行研究，發(fā)現 C401、C599、C651、C769和C1379等5個contigs攜帶可轉移的耐藥基因，并在這些contigs上面發(fā)現了1類和2類整合子的結構；對質粒序列的研究發(fā)現，基因組數據中存在一個可能與質粒

15、復制相關的基因，11個與接合相關的基因，可能與多個耐藥基因的轉移有關。MLST研究發(fā)現該菌株屬于 ST389，為首次發(fā)現攜帶 blaVIM-2和blaPER-1的ST389銅綠假單胞菌。
　　結論：
　　1、我院頭孢他啶耐藥銅綠假單胞菌感染以引起中老年、危重患者的呼吸道感染為主，對頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌，對常用多種抗生素耐藥率高，多重耐藥和泛耐藥現象嚴重。
　　2、表型確證實驗檢測我院頭孢他啶耐藥的銅綠假單胞菌，產

16、ESBLs菌株檢出率為20.7%；產酶株和非產酶株對哌拉西林、氨曲南、美羅培蘭、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南耐藥率均較高，無統(tǒng)計學差異；產酶株對頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星的耐藥率顯著高于非產酶株，且產酶株的泛耐藥菌株和全耐藥菌株比率顯著高于非產酶株。
　　3、我院2011年至2012年6月臨床分離的頭孢他啶耐藥銅綠假單胞菌產ESBLs以PER型最常見。
　　4、高通量測序可快速、全面、準確