骨髓間充質干細胞促進結腸癌進展及AMPK-mTOR介導NF-κB信號通路對其調(diào)節(jié)作用.pdf

1、近年來MSC由于其在免疫調(diào)節(jié)、組織修復中的重要作用被投入臨床研究，而與此同時，MSC對腫瘤的作用也被人們所擔憂。其中MSC對結腸癌細胞的作用與相應機制依然不清楚。
　　目的：
　?。?）闡明MSC上清對結腸癌細胞系生物學特性的影響。
　?。?）對相應機制以及對結腸癌中重要的信號通路的影響進行進一步的研究。
　?。?）明確MSC上清對結腸癌細胞成瘤性的影響。
　　方法：
　?。?）以α-MEM做為對照，

2、使用MSC的24h上清（MSC-CM）刺激結腸癌細胞系后24h，使用MTT法檢測6d中結腸癌細胞系增殖的變化，使用BrdU、Ki67熒光染色的方法分別檢測結腸癌細胞S期與增殖期細胞的比例變化、JC-1測定結腸癌細胞線粒體膜電位的變化以及PI染色法確定細胞周期的變化，并同時使用Transwell檢測結腸癌細胞遷移能力的變化，在將MSC-CM與結腸癌細胞系混合后軟瓊脂半固體培養(yǎng)基與平板培養(yǎng)檢測克隆形成能力的變化。
　?。?）MSC-C

3、M刺激24h后，使用western blot（免疫印跡）檢測細胞周期相關蛋白P53、P16、P21的變化，同時使用QPCR檢測RNA水平的變化，隨后使用western blot、QPCR檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、干性相關標記物c-myc、OCT-4、Sox-2在蛋白與RNA水平的表達，同時使用ELISA檢測MSC-CM以及濃縮后的MSC-CM中IL-6、IL-8的表達。并同時使用QPCR與western blot確定MSC-C

4、M刺激24h后AMPK/mTOR通路以及NF-κB通路的變化，凝膠遷移實驗（EMSA）檢測NF-κB轉錄活性的變化。
　?。?）將濃縮50倍的MSC-CM與結腸癌細胞系腹腔注射入Balb/c體內(nèi)，通過監(jiān)測小鼠體重、腫瘤轉移小鼠數(shù)量以及對小鼠腸免疫組化檢測HE、Ki67、E-Cadherin的變化。
　　結果：
　　（1）與對照培養(yǎng)基相比，MSC-CM刺激后的結腸癌細胞系HCT-116與LOVO增殖明顯增加，同時 S期細

5、胞與增殖期細胞比例也有顯著增加。與此同時12h時結腸癌細胞遷移比率、14d后結腸癌細胞克隆形成數(shù)量、大小也明顯增加，結腸癌細胞的凋亡比率下降、細胞周期中G1期比例下降，S期與G2期上升。
　?。?）與對照培養(yǎng)基相比，MSC-CM刺激后結腸癌細胞系中的細胞周期、凋亡相關蛋白P53、Bax蛋白與RNA水平表達受到抑制，抑制凋亡蛋白Bcl-2在RNA水平表達上升，同時P21、P16表達也受到抑制，結腸癌細胞系干性基因c-myc、oct-

6、4、sox-2在RNA水平表達上升，c-myc、sox-2在蛋白水平的表達也有增加。與此同時，使用ELISA確認了相對于HCT-116上清中IL-6：240±52.91(pg/ml)、IL-8：220±36.06(pg/ml)，MSC-CM中IL-6的表達達到1083.33±144.34(pg/ml)，IL-8達到733.33±104.08(pg/ml)，在MSC-CM處理后的上清中，IL-6達到1406.67±143.64(pg/ml

7、)，IL-8達到830±65.57(pg/ml)，而在50倍濃縮后的MSC-CM中，IL-6達到41700±1808.31(pg/ml)，IL-8達到29600±1967.23(pg/ml)。在檢測MSC-CM刺激后AMPK/mTOR與NF-κB通路的變化后發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平受到抑制，mTOR磷酸化水平上升，NF-κB通路中P65亞基磷酸化上升，抑制因子IKBα磷酸化降低，IKBα降解增加，同時NF-κB轉錄活性也得到增強。

8、　　(3)進一步使用濃縮后的MSC-CM與HCT-116混合腹腔注射入 Balb/c小鼠，能夠得出小鼠體重下降、結腸成瘤數(shù)量上升，同時瘤體中HE、Ki67染色陽性細胞數(shù)目增加，E-Cadherin降低。
　　結論：
　　在MSC-CM的刺激下，結腸癌細胞系增殖、遷移、克隆形成能力增加、凋亡受到抑制，同時結腸癌細胞系細胞周期G1期比例下降、S期與G2期上升。細胞周期相關蛋白表達增高，而抑制凋亡蛋白比例下降，結腸癌細胞干性增強。