人Il-37重組蛋白的表達純化及體外生物學性質(zhì)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、人白細胞介素-37(Interleukin-37,IL-37)屬于IL-1家族,處于人類2號染色體的IL-1家族基因簇上。IL-37是已知為數(shù)不多的具有炎癥抑制功能的細胞因子之一,其表達水平的變化與多種炎癥及免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。有關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者IL-37表達水平研究顯示,與正常對照比較,SLE患者血清IL-37水平明顯增高。另有研究發(fā)現(xiàn)類風濕關(guān)節(jié)炎患

2、者的血漿IL-37表達水平顯著高于正常對照。除此之外,Boraschi等人發(fā)現(xiàn)IL-37在人冠脈和頸動脈粥樣硬化斑塊的泡沫細胞中高表達,揭示在動脈粥樣硬化性疾病的進展中IL-37可能充當一定角色。此外,最近的一系列研究發(fā)現(xiàn)IL-37蛋白或mRNA的表達水平增高與炎癥性腸病、格林巴利綜合征、慢性乙肝、病態(tài)肥胖、甲狀腺功能亢進和強制性脊柱炎的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)。值得注意的是,近期一項針對人免疫缺陷病毒(Human immunodeficien

3、cyvirus1,HIV-1)感染人群的隊列研究表示,與正常人外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中IL-37 mRNA水平相比,HIV感染者PBMCs中穩(wěn)態(tài)IL-37 mRNA表達水平明顯升高。此外,HIV-1感染者血漿中單核細胞炎性標記物sCD14表達水平與其PBMC中IL-37 mRNA表達水平呈正相關(guān)。此項研究還觀察到HIV儲存庫(PBMCs中總HIV-1DNA)與P

4、BMC中IL-37mRNA表達水平具有顯著相關(guān)性。
  目的:
  1.比較HIV感染者與正常人群血漿IL-37、IP-10等細胞因子表達水平差異,分析HIV感染者血漿IL-37表達水平與外周血CD4+T細胞數(shù)量及外周血HIV RNA的相關(guān)性;
  2.構(gòu)建人IL-37原核表達載體,對其進行誘導(dǎo)表達并建立IL-37原核重組蛋白純化技術(shù),并在分子和細胞水平鑒定IL-37重組蛋白的部分生物學性質(zhì),包括:IL-37重組蛋白是

5、否能夠抑制THP-1/A549細胞對炎癥刺激因子的應(yīng)答;IL-37重組蛋白是否保留與其受體IL-18Rα特異性結(jié)合的能力,為利用動物疾病模型研究IL-37的炎癥抑制功能奠定一定的基礎(chǔ)。
  方法:
  1.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定HIV感染者及健康對照人群血漿中IL-37、IL-10、IP-10:將特異性識別各細胞因子的捕獲抗體包被到酶標板上,4℃孵

6、育過夜;洗板3次后加入封閉液,室溫孵育1h;血漿以(原液∶PBS)1∶2稀釋,標準品按說明書稀釋到不同濃度,各加入酶標板不同孔洞中,以稀釋液作為空白對照,然后室溫孵育2h;總計洗板5次后加入檢測工作液(檢測抗體和HRP標記的二抗),隨后室溫孵育1h;總計洗板7次后加入顯色底物,置于室溫孵育30min,然后加入終止液結(jié)束反應(yīng),用酶標儀在450nm波長處檢測后分析結(jié)果。
  2.IL-37變體重組蛋白原核表達載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達以及純

7、化操作:通過PCR從pCDH-hIL-37-T2A-copGFP載體上擴增出人IL-37的基因,使用pET-19b質(zhì)粒,構(gòu)建IL-37的原核表達載體,并在E.coli BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達N端帶有6個組蛋白(His6)標簽的融合蛋白,利用鎳離子親和層析柱純化得到IL-37的重組蛋白,并使用SDS-PAGE和Western Blot(使用Anti-His和Anti-IL37單克隆抗體)對重組蛋白進行鑒定,并對IL-37進

8、行部分生物學功能分析。
  結(jié)果:
  1.本研究比較了HIV感染者和正常人群血漿IP-10、IL-10和IL-37表達水平,結(jié)果顯示:HIV感染者血漿中IP-10和IL-37表達水平顯著高于正常人群,而IL-10在HIV感染者和正常人群中無明顯差異;對HIV感染者IP-10、IL-10和IL-37水平與CD4+T細胞計數(shù)作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),血漿中IP-10、IL-10和IL-37水平與CD4計數(shù)均不具有明顯相關(guān)性。
 

9、 2.本實驗構(gòu)建了E.coli重組表達載體pET-19b-His6-hIL-37:在E.coli中實現(xiàn)了IL-37的高效誘導(dǎo)表達,初步建立了IL-37蛋白純化工藝,利用該工藝路線我們從細菌誘導(dǎo)物中獲得高純度的IL-37蛋白。進行IL-37相關(guān)功能分析表明,在細胞培養(yǎng)液中加入一定量的IL-37重組蛋白后,使用LPS和IL-1β分別刺激人巨噬細胞系THP-1細胞和人肺上皮細胞系A(chǔ)549細胞,炎癥因子IL-6的表達水平受到一定程度抑制,且我們

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