DATS和辛伐他汀對骨肉瘤細胞的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 DATS對骨肉瘤細胞的作用及機制研究
　　目的：
　　1.觀察DATS對骨肉瘤細胞的作用。
　　2.探尋DATS抑制骨肉瘤生長的可能作用機制。
　　方法：
　　1.應用不同濃度的DATS處理骨肉瘤細胞MG63和MNNG/HOS24h，48h，72h后，用CCK-8法檢測骨肉瘤細胞細胞活性，分析DATS對骨肉瘤細胞增殖的影響。
　　2.應用不同濃度D

2、ATS孵育MG63和MNNG/HOS細胞48h后，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化，觀察DATS對骨肉瘤細胞的形態(tài)學影響。
　　3.應用細胞周期檢測試劑盒檢測DATS處理骨肉瘤細胞MG63和MNNG/HOS后的細胞周期分布變化，觀察DATS對骨肉瘤細胞周期分布的影響。應用Western Blot檢測細胞周期相關蛋白cyclin D1、p21、p27的表達，分析DATS誘導骨肉瘤細胞G0/G1周期阻滯的可能分子機制。
　　4.

3、應用細胞凋亡檢測試劑盒檢測DATS處理骨肉瘤細胞MG63和MNNG/HOS后的細胞細胞凋亡比率，觀察DATS對骨肉瘤細胞凋亡的影響。
　　5.應用熒光探針DCFH-DA通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測DATS誘導MG63和MNNG/HOS細胞內(nèi)活性氧(ROS)變化水平。
　　6.應用熒光探針JC-1檢測DATS處理后的骨肉瘤細胞MG63和MNNG/HOS的線粒體膜電位變化。
　　7.DATS處理MG63和MNNG/HOS

4、細胞后，提取總蛋白，應用Western Blot檢測PI3K/Akt信號通路中PI3Kp110β、PI3Kp85α、Akt、phosoho-Akt的表達及下游分子Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-XL的表達，檢測線粒體凋亡通路中cytochrome c、caspase-9、caspase-3、cleaved PARP蛋白表達變化。分析DATS誘導骨肉瘤細胞凋亡的可能分子機制。
　　結果：
　　1.DATS對骨肉瘤細胞MG6

5、3和MNNG/HOS的活性抑制作用隨藥物濃度和處理時間的增加而增強。DATS對MG63細胞活性有著更強的抑制作用。
　　2.DATS處理細胞48h后，導致骨肉瘤細胞發(fā)生明顯的形態(tài)變化。
　　3.DATS誘導MG63和MNNG/HOS細胞發(fā)生G0/G1周期阻滯，抗氧化劑NAC能夠逆轉DATS誘導的G0/G1周期阻滯。DATS處理骨肉瘤細胞后cyclin D1蛋白表達下調，而p21和p27蛋白的表達明顯上調。
　　4.DA

6、TS能以劑量和時間依賴的方式誘導骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡。NAC預處理細胞后可逆轉DATS誘導的凋亡。
　　5.DATS作用MG63和MNNG/HOS16h后，細胞內(nèi)ROS水平明顯增加。DATS隨著濃度增加和作用時間延長而明顯增加骨肉瘤細胞內(nèi)ROS水平。NAC則完全消除了ROS的增加。
　　6.DATS作用骨肉瘤細胞后，線粒體膜電位水平發(fā)生明顯下降，NAC對抗DATS對線粒體膜電位的破壞作用。
　　7.DATS作用后骨肉瘤細

7、胞內(nèi)PI3Kp110β，PI3Kp85α，Akt和p-Akt的蛋白表達呈現(xiàn)與劑量相關的下降。同時Bad和Bax表達上調，而Bcl-2和Bcl-XL表達下調，細胞內(nèi)cytochrome c及活化的caspase-9和caspase-3水平，cleaved PARP蛋白表達明顯增加。說明DATS通過下調PI3K/Akt通路和激活線粒體凋亡通路誘導骨肉瘤細胞凋亡。同時，DATS對PI3K/Akt信號通路起到了PI3K/Akt信號通路抑制劑LY

8、294002的類似作用，而LY294002和DATS共同處理細胞時起到了明顯的協(xié)同抑制作用。NAC完全逆轉DATS對PI3K/Akt通路蛋白的下調，說明DATS誘導的骨肉瘤細胞MG63和MNNG/HOS凋亡是依賴于ROS增加導致的PI3K/Akt信號通路下調起作用的。
　　結論：
　　1.DATS具有明顯的抑制骨肉瘤細胞生長的作用。
　　2.DATS通過增加ROS的產(chǎn)生及下調cyclin D1、上調p21和p27蛋白表

9、達而誘導骨肉瘤細胞G0/G1周期阻滯。
　　3.DATS通過誘導ROS產(chǎn)生導致骨肉瘤細胞線粒體膜電位水平下降。
　　4.DATS通過增加ROS增加誘導骨肉瘤細胞凋亡，其分子機制可能與ROS依賴的PI3K/Akt信號通路下調及線粒體凋亡通路活化有關。
　　第二部 分辛伐他汀對骨肉瘤細胞的作用及機制研究
　　目的：
　　1.觀察辛伐他汀對骨肉瘤細胞的作用。
　　2.探尋辛伐他汀抑制骨肉瘤生長的可能信號通路

10、及分子機制。
　　方法：
　　1.應用不同濃度的辛伐他汀處理骨肉瘤細胞MNNG/HOS24h，48h，72h后，用CCK-8法檢測骨肉瘤細胞細胞活性，分析辛伐他汀對骨肉瘤細胞增殖的影響。
　　2.應用細胞劃痕實驗（愈傷實驗）檢測辛伐他汀處理骨肉瘤細胞MNNG/HOS后的細胞遷移距離，觀察辛伐他汀對骨肉瘤細胞遷移能力影響。
　　3.應用底面鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室檢測辛伐他汀對骨肉瘤細胞侵

11、襲能力的影響。應用Western Blot檢測基質金屬蛋白酶(MMPs)MMP-2、MMP-9的蛋白表達，分析辛伐他汀抑制抑制骨肉瘤細胞遷移侵襲的可能分子機制。
　　4.應用細胞周期檢測試劑盒檢測辛伐他汀處理骨肉瘤細胞MNNG/HOS后的細胞周期分布變化，觀察辛伐他汀對骨肉瘤細胞周期分布的影響。應用Western Blot檢測細胞周期相關蛋白cyclin D1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達，分析辛伐他汀誘導骨肉瘤細胞G

12、0/G1周期阻滯的可能分子機制。
　　5.應用細胞凋亡檢測試劑盒檢測辛伐他汀對骨肉瘤細胞凋亡的影響。應用Western Blot檢測PI3K/Akt信號通路中PI3K、Akt、p-Akt的表達及下游的Bax、Bcl-2、cleaved PARP蛋白表達變化。分析辛伐他汀誘導骨肉瘤細胞凋亡的可能分子機制。
　　6.應用PI3K/Akt信號通路激活劑IGF-1和特異性抑制劑LY294002及不同濃度的辛伐他汀分別或者共同作用MN

13、NG/HOS細胞后，提取總蛋白，檢測PI3K、Akt、p-Akt的表達及下游的Bax、Bcl-2、cleaved PARP蛋白表達變化，分析PI3K/Akt信號通路在辛伐他汀誘導骨肉瘤細胞凋亡中的作用。
　　7.建立骨肉瘤MNNG/HOS細胞的動物模型，給予腹腔注射辛伐他汀或生理鹽水，定期稱量裸鼠體重，測量計算移植瘤的體積。觀察辛伐他汀對動物模型中骨肉瘤的生長抑制情況。
　　結果：
　　1.辛伐他汀以時間和濃度依賴方式

14、抑制骨肉瘤細胞MNNG//HOS的增殖。
　　2.辛伐他汀抑制骨肉瘤細胞MNNG/HOS的遷移，并呈劑量依賴性。
　　3.辛伐他汀抑制骨肉瘤細胞MNNG/HOS的侵襲，并呈劑量依賴性。同時，MNNG/HOS細胞中的MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯下降，說明辛伐他汀抑制骨肉瘤細胞侵襲的分子機制可能與下調MMP-2和MMP-9蛋白的表達有關。
　　4.辛伐他汀誘導MNNG/HOS細胞G0/G1周期阻滯。Western

15、Blot結果顯示，細胞內(nèi)cyclin D1、CDK2、CDK4蛋白的表達明顯下調，而p21和p27蛋白的表達則被明顯上調，這個結果解釋了辛伐他汀誘導骨肉瘤細胞G0/G1周期阻滯的可能分子機制。
　　5.辛伐他汀作用后，MNNG/HOS細胞凋亡比率明顯增加并與劑量正相關。Western blot結果顯示，辛伐他汀作用后PI3K和p-Akt(Ser473)蛋白的表達明顯下調，而總Akt的表達沒有顯著變化。同時，Bax的表達增加，而Bc

16、l-2的表達下降，導致Bax/Bcl-2的表達比率明顯上升，下游cleaved PARP的表達增加。
　　6.IGF-1能通過上調PI3K和p-Akt蛋白的表達而活化PI3K/Akt信號通路，而辛伐他汀與之作用相反，起到了類似于LY294002的通路抑制作用，其下游的Bax/Bcl-2的表達比率也發(fā)生了對應的變化。IGF-1與辛伐他汀共同作用MNNG/HOS細胞后辛伐他汀對PI3K/Akt信號通路的抑制作用被逆轉，證明辛伐他汀誘導

17、凋亡的主要分子機制涉及PI3K/Akt信號通路的失活。
　　7.成功利用裸鼠建立骨肉瘤細胞的動物模型。辛伐他汀對荷瘤裸鼠的體重及日?；顒記]有明顯影響，具有較好的耐受性，辛伐他汀組的移植瘤體積要明顯小于對照組腫瘤體積，證實了辛伐他汀抗骨肉瘤作用的有效性。
　　結論：
　　1.辛伐他汀能夠有效的抑制體外骨肉瘤細胞系的增殖并明顯抑制動物模型中骨肉瘤的生長。
　　2.辛伐他汀抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲，可能與下調MMP-2