抗環(huán)瓜氨酸肽四價小分子抗體的構建、可溶性表達與鑒定.pdf

1、目的：通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)構建抗環(huán)胍氨酸肽四價小分子抗體（TeAb-anti-CCP-ScFv-P53），并進行可溶性表達及鑒定。
　　方法：（1）重疊PCR連接抗CCP-ScFv與HSA-P53基因片段，構建TeAb-anti-CCP-ScFv-P53目的片段。將目的片段分別轉入以胞內表達為主的pET28a系統(tǒng)；以周質表達為主的pET22k、pAD22k系統(tǒng)；以胞內可溶表達為主的pETSumo、pETGST、pETNus、p

2、MBPc系統(tǒng)；以培養(yǎng)基可溶表達為主的pMBPp系統(tǒng)。菌落PCR擴增，抽提基因組DNA測序鑒定。（2）將測序正確的陽性克隆轉入BL21(DH3)感受態(tài)細胞，IPTG誘導可溶表達，SDS-PAGE凝膠及Western blot鑒定目標蛋白表達情況，選取有可溶表達的系統(tǒng)擴大培養(yǎng)、鎳層析柱親和純化。（3）ELISA評價其特異性；非競爭ELISA法測定其親和常數(shù)(Ka)；間接免疫熒光法鑒定其在體活性。
　　結果：（1）瓊脂糖凝膠電泳證實目的

3、片段構建成功；質粒DNA測序表明載體與目的片段連接正確。（2）SDS-PAGE凝膠及Western blot結果顯示pETGST及pMBPp系統(tǒng)未見表達；pET28a、pET22K及pAD22K系統(tǒng)尚有蛋白表達，但主要在包涵體內，可溶性表達少，未能純化出足量蛋白用于下一步試驗；pSumo融合表達系統(tǒng)能夠純化到較高的純度，但使用Sumo相應酶無法切除融合標簽；pNus系統(tǒng)細胞裂解后形成高聚體，無法通過鎳層析柱親和層析得到富集；pMBPc系

4、統(tǒng)獲得了一定量的可溶表達，純化成功。選取pMBPc系統(tǒng)進一步擴大培養(yǎng)。（3）可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53特異性與CCPII的結合，明顯高于SSA、SSB、Sm、snRNP和RF；可溶性TeAb-anti-CCP-ScFv-P53親和常數(shù)Ka≌3.61×108-4.28×109M-1；使用間接免疫熒光法以AKA、APF為底物證實其具有在體活性。
　　結論：（1）TeAb-anti-CCP-ScFv-P53可在p