UTP通過Ca2+信號和PTEN通路抑制胃癌的分子機制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 P2Y6受體在人胃癌組織及胃癌細胞系中的表達
　　目的:
　　觀察P2Y6受體在人胃癌與癌旁正常組織以及胃癌細胞系與正常胃黏膜細胞中的表達變化。
　　方法:
　　采用免疫組化技術檢測P2Y6受體在胃癌組織及癌旁正常組織的蛋白表達情況，并與臨床病理特征以及病人的生存預后進行相關性分析;qRT-PCR檢測P2Y6受體在胃癌組織與癌旁正常組織以及癌細胞系與正常胃黏膜細胞G

2、ES-1 mRNA水平的表達;Western blot檢測P2Y6受體在胃癌細胞系與正常胃黏膜細胞GES-1蛋白水平的表達。
　　結果:
　　免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)P2Y6受體蛋白在胃癌組織的表達低于癌旁正常組織，而且發(fā)現(xiàn)P2Y6受體在胃癌組織標本里面的蛋白表達值高的，腫瘤小、分化好、淋巴結轉移少以及生存時間長;qRT-PCR結果顯示P2Y6受體mRNA在胃癌組織的表達低于癌旁正常組織，在胃癌細胞系的表達低于正常胃黏膜細胞GES-

3、1的表達;Western blot結果表明P2Y6受體蛋白在胃癌細胞系的表達低于正常胃黏膜細胞GES-1的表達。
　　結論:
　　P2Y6受體在人胃癌組織以及胃癌細胞系中低表達，提示其在胃癌過程中可能起到抑癌基因的作用。
　　第二部分 UTP對胃癌細胞行為學的影響
　　目的:
　　研究UTP對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲以及其體內、外生長的影響。
　　方法:
　　CCK8實驗檢測UTP、UDP、Sp

4、iperone、CPA、MRS2578、shP2Y6、BAPTA-AM和2-APB對胃癌細胞MKN-45和SGC-7901增殖的影響;流式細胞技術檢測UTP、UDP、Spiperone和CPA對胃癌細胞SGC-7901周期的影響;Western blot檢測UTP、UDP、Spiperone和CPA對胃癌細胞Rb的磷酸化和Cyclin D1的影響;細胞劃痕實驗檢測UTP對胃癌細胞MKN-45和SGC-7901遷移能力的影響;Transw

5、ell侵襲實驗檢測UTP對MKN-45和SGC-7901及GES-1細胞侵襲能力的影響;裸鼠皮下成瘤實驗檢測UTP對胃癌的體內生長的影響。
　　結果:
　　CCK8實驗結果顯示UTP、UDP、Spiperone和CPA抑制胃癌細胞MKN-45和SGC-7901的增殖，MRS2578、shP2Y6、BAPTA-AM和2-APB能恢復UTP對胃癌細胞增殖的抑制;流式細胞技術結果表明UTP、UDP、Spiperone和CPA阻滯胃

6、癌細胞SGC-7901細胞周期在G1期;Western blot顯示UTP、UDP、Spiperone和CPA抑制胃癌細胞Rb的磷酸化和Cyclin D1的表達;細胞劃痕實驗顯示UTP抑制胃癌細胞MKN-45和SGC-7901的遷移能力;Transwell侵襲實驗證實UTP抑制MKN-45和SGC-7901細胞的侵襲能力，但不影響正常胃黏膜細胞GES-1;裸鼠皮下成瘤實驗結果顯示UTP抑制胃癌的體內生長，而且可被P2Y6受體拮抗劑以及干

7、擾P2Y6受體所逆轉。
　　結論:
　　UTP通過P2Y6受體抑制胃癌的體內、外生長，和抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。
　　第三部分 UTP抑制胃癌細胞的分子機制研究
　　第一節(jié)
　　目的:
　　研究UTP抑制胃癌細胞增殖的分子機制。
　　方法:
　　單細胞Cd+成像技術檢測UTP、UDP、MRS2578對胃癌細胞MKN-45和SGC-7901細胞內Ca2+的影響;0Ca2+和2mM Ca2+

8、的時候，UTP、UTP+U73122、UTP+2-APB，對胃癌細胞內Ca2+水平的影響;0Ca2+的時候，UTP、CPA、Spiperone對胃癌細胞內Ca2+水平的影響;0Ca2+的時候，CPA或者Spiperone刺激之后再用UTP刺激對胃癌細胞內Ca2+水平的影響。Western blot檢測UTP、UDP、Spiperone、UTP+MRS2578以及UTP+2-APB對β-catenin(Ser675)的影響。
　　結

9、果:
　　UTP、UDP增加胃癌細胞MKN-45和SGC-7901內Ca2+水平，MRS2578抑制這一作用;0Ca2+和2mM Ca2+的時候，UTP都增加細胞內Ca2+，U73122和2-APB都可以抑制這一作用;0Ca2+的時候，UTP、CPA、Spiperone增加細胞內Ca2+;0Ca2+的時候，CPA或者Spiperone刺激增加細胞內Ca2+，再用UTP刺激檢測不到Ca2+變化的信號。UTP、UDP、Spiperon

10、e抑制β-catenin(Ser675)的表達，而MRS2578和2-APB可以逆轉這一作用。
　　結論:
　　1、UTP通過P2Y6受體引起細胞內Ca2+增加，UTP引起的細胞內Ca2+增加是由于內Ca2+的釋放及繼發(fā)外Ca2+的內流。
　　2、UTP通過P2Y6受體引起內Ca2+增加，抑制β-catenin(Ser675)磷酸化的表達。
　　第二節(jié)
　　目的:
　　研究UTP抑制胃癌細胞遷移和侵襲

11、的分子機制。
　　方法:
　　Western blot檢測PTEN在GES-1和MKN-45以及SGC-7901細胞中的表達情況，以及UTP對胃癌細胞PTEN磷酸化水平、Vimentin蛋白表達水平的影響。
　　結果:
　　PTEN基因在胃癌細胞MKN-45和SGC-7901的表達低于正常胃黏膜細胞GES-1。UTP上調了胃癌細胞內PTEN磷酸化水平，抑制了Vimentin蛋白的表達。
　　結論: