長(zhǎng)白豬Gli家族鋅指結(jié)構(gòu)3(Gli3)的分子克隆和表達(dá)分析及GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬表型分析.pdf

1、本文通過(guò)以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分、長(zhǎng)白豬Gli家族鋅指結(jié)構(gòu)3(Gli3)的分子克隆和表達(dá)分析
　　目的:Gli家族鋅指結(jié)構(gòu)3(Gli3)在胚胎發(fā)育，器官形成方面有重要作用，是Hedgehog(Hh)信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，也是非常保守的調(diào)控因子。Gli3基因突變，引起多種綜合征，以及器官畸形。作為大動(dòng)物長(zhǎng)白豬中的Gli3基因在Genbank中只有幾個(gè)外顯子，沒(méi)有完成的基因序列。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)已知幾個(gè)外顯子，克隆

2、出全長(zhǎng)的Gli3基因。
　　方法:(1)提取長(zhǎng)白豬肺組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;(2)通過(guò)已知外顯子和基因同源性設(shè)計(jì)Gli3基因引物，克隆Gli3基因中后段序列，利用RACE技術(shù)克隆Gli3基因兩端序列，即可得到Gli3的全長(zhǎng)序列;(3)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Gli3基因的開(kāi)放閱讀框，Gli3蛋白的生化特征，N-糖基化，磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)，模擬三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，生物進(jìn)化樹(shù);(4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Gli3基因在長(zhǎng)白豬胎兒110天和成年

3、豬中的心、肝、脾、肺、腎、腦、皮、肌肉、舌等器官和組織中的基因相對(duì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:獲得長(zhǎng)白豬Gli3基因全長(zhǎng)序列6289個(gè)堿基，完整的閱讀框，其中包括從292到5052共4761堿基編碼序列，291個(gè)堿基為5'端非編碼區(qū)，1237個(gè)堿基為3'端末端非編碼區(qū)。長(zhǎng)白豬Gli3基因共編碼1587個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析蛋白分子量約為169kDa，等電點(diǎn)約為7.2，沒(méi)有預(yù)測(cè)到N端的信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，沒(méi)有O連接糖基化位點(diǎn)，有6個(gè)N連

4、接糖基化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)到Gli3蛋白有大量磷酸化位點(diǎn)。Gli3蛋白有4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的保守結(jié)構(gòu)。無(wú)規(guī)則卷曲在Gli3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中占主要地位。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Gli3基因結(jié)果顯示在長(zhǎng)白豬胎兒和成年長(zhǎng)白豬的脾，肺，腎，腦均有高表達(dá)。
　　結(jié)論:通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆出長(zhǎng)白豬Gli3基因全長(zhǎng)序列。為長(zhǎng)白豬中Gli3基因的研究提供了分子基礎(chǔ)。
　　第二部分、GIPR血轉(zhuǎn)基因豬表型分析
　　目的:通過(guò)克隆方法建立的G

5、IPR過(guò)表達(dá)顯性抑制的轉(zhuǎn)基因豬模型，研究GIP在糖代謝穩(wěn)態(tài)中的作用。
　　方法:對(duì)2月齡和5月齡的GIPRdn轉(zhuǎn)基因和野生型長(zhǎng)白豬進(jìn)行口服葡萄糖耐量測(cè)試，分析血糖和胰島素含量。糖耐量測(cè)試結(jié)束，分離豬的胰腺，稱(chēng)重，免疫組化方法分析GIPRdn轉(zhuǎn)基因和野生型長(zhǎng)白豬胰腺中Ki67和Insulin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬2月齡口服糖耐量測(cè)試1h后，血糖明顯高于對(duì)照組，1.5h后胰島素含量也明顯比對(duì)照組高，證明GI

6、PRdn轉(zhuǎn)基因豬糖耐量確實(shí)受到損害;5月齡口服葡萄糖1.5h后，血糖也明顯低于對(duì)照組，而胰島素僅僅0.5h后就明顯高于對(duì)照組，確認(rèn)GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬糖耐量依然受到損害。GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬從2月齡到5月齡表現(xiàn)出糖耐量受損基本沒(méi)有變化，而胰島素分泌明顯減少。GIPR血轉(zhuǎn)基因豬胰腺重量明顯減輕。免疫組織化學(xué)顯示insulin明顯降低，胰腺細(xì)胞增殖明顯減少。
　　結(jié)論:過(guò)表達(dá)顯性抑制的GIPRdn轉(zhuǎn)基因豬從2月齡到5月齡表現(xiàn)出糖耐量受