脈沖電磁場通過初級纖毛和BMP-BMPRII-Smad1-5-8信號途徑促進骨形成的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種因骨密度降低、骨量減少而導致骨折危險性增加的全身性骨骼疾病，目前還沒有療效好且副作用低的骨質(zhì)疏松治療藥物。脈沖電磁場（PEMFs）作為一種非侵入物理治療手段，被認為是安全有效的骨質(zhì)疏松癥治療方法之一，本實驗組前期研究已篩選出能夠顯著促進骨形成的脈沖電磁場參數(shù)，包括磁場強度、頻率、作用時間等。在這些參數(shù)條件下，脈沖電磁場顯著促進了間充質(zhì)干細胞和成骨細胞的成骨性分化及礦化成熟，并能夠提高生長大鼠的峰值骨量。然而，脈沖

2、電磁場促進骨形成的作用機理至今仍不清楚，是制約電磁場應用于骨質(zhì)疏松治療的主要瓶頸。本實驗組在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，50 Hz0.6mT的脈沖電磁場是促進骨形成的最佳參數(shù)之一，在該參數(shù)條件下脈沖電磁場促進骨形成依賴于細胞表面的“天線樣”細胞器——初級纖毛。鑒于上述研究結(jié)果，本論文開展了脈沖電磁場促進骨形成與初級纖毛及相關(guān)信號途徑關(guān)系的研究。
　　首先，實驗以大鼠顱骨中分離得到的骨細胞和成骨細胞為材料，利用免疫組織化學染色、免疫熒光染色

3、以及western blot技術(shù)，對兩者形態(tài)、成骨性相關(guān)蛋白的表達等進行了比較研究。結(jié)果表明：骨細胞多呈樹突狀，而成骨細胞多呈長梭形；成骨細胞堿性磷酸酶（ALP）的活性、成骨相關(guān)因子I型膠原（COL-I）和骨鈣素（OC）的表達量均顯著高于骨細胞；成骨細胞對外界促進骨形成的因子更加敏感，因此后續(xù)研究均采用成骨細胞。
　　其次，為了研究PEMFs促進骨形成是否依賴于BMP2-Smad信號途徑，實驗用50 Hz0.6mT PEMFs處理

4、大鼠顱骨成骨細胞不同時間后，通過western blot檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8蛋白的表達量，免疫熒光染色法檢測p-Smad1/5/8核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEMFs能夠顯著提高BMP-2的表達量，促進Smad1/5/8快速發(fā)生磷酸化，并使 p-Smad1/5/8發(fā)生核轉(zhuǎn)位，說明50 Hz0.6mT PEMFs能夠激活BMP2-Smad信號途徑。為檢測激活BMP2-Smad信號途徑是否

5、為PEMFs促進骨形成所必需，本實驗用BMPs阻斷劑Noggin和BMPR1激酶的抑制劑LDN1459阻斷BMP2-Smad信號途徑后，檢測了成骨相關(guān)指標的變化。發(fā)現(xiàn)PEMFs誘導的ALP活性升高、骨形成相關(guān)蛋白表達的增加以及鈣化結(jié)節(jié)形成增多的現(xiàn)象均被抑制，說明 PEMFs促進骨形成依賴于BMP2-Smad信號途徑。
　　最后，為了研究PEMFs激活BMP2-Smad信號途徑是否與初級纖毛有關(guān)，本實驗利用RNA干擾法抑制IFT88

6、的表達，從而抑制初級纖毛的發(fā)生后，檢測BMP2-Smad信號途徑的激活是否受到影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEMFs促進BMP-2和p-Smad1/5/8的表達以及p-Smad1/5/8發(fā)生核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象均被抑制，PEMFs激活BMP2-Smad信號途徑的作用消失。因此推測BMP2-Smad信號途徑中的某種蛋白可能定位于初級纖毛中，為此實驗通過免疫熒光染色技術(shù)，對BMP2的三種受體BMPRIA、BMPRIB和BMPRII進行了初級纖毛共定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

7、BMPRII定位于初級纖毛根部，同時還發(fā)現(xiàn)PEMFs能夠顯著促進BMPRIB和BMPRII蛋白的表達。通過RNA干擾法抑制初級纖毛后。BMPRII定位于初級纖毛基部及BMPRII表達量增加的現(xiàn)象均消失。結(jié)果說明BMPRII是聯(lián)接初級纖毛和BMP2-Smad信號途徑的關(guān)鍵蛋白。為了研究BMPRII在PEMFs促進骨形成過程中的作用，本實驗進而用RNA干擾法抑制BMPRII的表達后檢測成骨性指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEMFs提高ALP活性，促進骨形成