激活突變的SHP-2酪氨酸酶對LOVO腸癌細胞的惡性生物學行為的影響及EMT探討.pdf

1、【背景】：
　　惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一，近年來，惡性腫瘤呈現發(fā)病率升高和發(fā)病早齡化的趨勢。國內外的多種研究發(fā)現，機體里正常的細胞變成惡性細胞，需要機體內外包括癌基因在內的多種因素的作用，這個轉變過程是分多個階段逐步發(fā)生的復雜的長期過程。人們對癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究已經有多年研究。
　　結腸癌是西方國家常見的惡性腫瘤，也是我國城市地區(qū)多發(fā)的消化系統惡性腫瘤。近二十年，結腸癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內一

2、直攀升。尤其在中國，結腸癌的發(fā)病率不低，而且死亡率也很高。然而結腸癌的病因和確切的分子機制還不完全清楚。
　　SHP-2(Src homology2-containing protein tyrosine phosphatase)是一種非受體型酪氨酸磷酸酶，會調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最開始是在努南綜合征(Noonan syndrome)和白血病中發(fā)現了 SHP-2的突變，后來有多個實驗室陸續(xù)在多種實體瘤中也發(fā)現了 SHP-2的突變，發(fā)

3、現SHP-2的突變在實體瘤中發(fā)揮了重要作用。SHP2-D61G的激活是SHP-2常見的激活突變之一，它會導致SHP-2中的結構域部分解離，暴露其PTP結構域的催化活性位點，從而導致SHP2酪氨酸磷酸酶活性的增強，進而參與下游多條信號途徑的活化。
　　上皮細胞間質轉化（epithelial-mesenchymal transitions)簡稱 EMT，指在特定的病理生理情況下，具有極性的上皮細胞失去極性，向具有活動能力的間質細胞轉變

4、并獲得侵襲和遷移能力，它的發(fā)生是多基因、多步驟、多階段的復雜過程。EM T是誘發(fā)腫瘤浸潤和轉移的早期關鍵事件，其與胃腸道腫瘤的侵襲轉移有密切關系，有多種基因和分子均參與到EMT的發(fā)生過程中，其表型主要是上皮樣蛋白marker E-cadherin(E-鈣粘蛋白）的表達減少，和間質樣蛋白marker表達的上調。結腸癌是上皮細胞腫瘤，在結腸癌的轉移中也會出現EMT。但 SHP2-D61G突變對結腸癌的增殖和迀移有是否有影響，在此過程中，是否

5、有EMT的發(fā)生尚未有明確報道。
　　綜合上述背景，本實驗設計了相關實驗方案來探索SHP2-D61G突變對結腸癌的增殖和迀移的影響，以及在此過程中，是否有EMT的發(fā)生。
　　【方法】：
　　(1)用 SHP-2+和 SHP-2D61G質粒轉染人結腸癌LOVO細胞，構建穩(wěn)定的轉染細胞模型。
　　(2)用 MTT，平板克隆形成實驗，軟瓊脂集落形成實驗檢測LOVO細胞轉染前后生長情況。
　　(3)用粘附試驗，劃痕試

6、驗，Transwell實驗檢測LOVO細胞轉染前后的迀移能力。
　?、欠治鲛D染前后細胞的EMT相關蛋白的表達情況，分析其與EMT相關性。
　　【結果】：
　　(1)成功構建了 SHP-2+和 SHP-2D61G染的人結腸癌LOVO細胞模型。
　　(2) SHP-2D61G突變對結腸癌LOVO細胞生長的影響： MTT實驗結果顯示，SHP_2D61G突變轉染后，細胞增值率明顯增加；平板克隆實驗和軟瓊脂集落形成實驗也表

7、明細胞的克隆形成率多于對照組。以上結果說明SHP-2D61G突變促進了結腸癌細胞的克隆形成與增殖能力。
　　(3)SHP-2D61G突變對結腸癌LOVO細胞轉移的影響：細胞劃痕實驗結果顯示，SHP-2D61t突變轉染后，細胞的迀移速度明顯高于對照組。粘附實驗和Transwell實驗結果發(fā)現，實驗組細胞的粘附能力和迀移能力明顯高于對照組，說明 SHP-2D61G突變有增強結腸癌細胞體外迀移的能力。
　　(4)SHP-2D61G

8、突變導致了 EMT的發(fā)生：Western blot檢測EMT相關蛋白marker， 結果發(fā)現，SHP-2D61　　【結論】：
　　(1)成功構建了 SHP-2+和 SHP-2D61GR染后的LOVO細胞模型；
　　(2)SHP-2D61e促進了 LOVO細胞增殖和迀移能力；
　?、?EMT在 SHP-2D61G對LOVO細胞生物