磁性富集熒光法快速檢測大腸桿菌的研究.pdf

1、隨著全球工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染和食品安全問題日趨嚴(yán)重。環(huán)境保護和食品安全已成為本世紀(jì)影響人類生存和發(fā)展的重要問題。腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic escherichia coli，EHEC)是人類食源性以及水源性病原體，食用被該菌污染的食物會導(dǎo)致腹瀉和腸炎，嚴(yán)重時將導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合癥，甚至死亡。EHEC以大腸桿菌O157∶H7血清型為代表菌株，呈暴發(fā)流行趨勢，且不斷發(fā)生變異。建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便

2、檢測大腸桿菌的方法，對環(huán)境監(jiān)測和臨床醫(yī)學(xué)流行病學(xué)診斷有現(xiàn)實意義。因此，為了研究大腸桿菌的高靈敏快速檢測方法，本文建立了一種基于萘酰亞胺標(biāo)記的DNA探針和磁性四氧化三鐵氧化石墨烯分離的大腸桿菌O157∶H7檢測方法。實驗結(jié)果表明，在一定條件下，O157∶H7數(shù)量的對數(shù)值和熒光強度與空白值熒光強度的比值(F/F0)呈線性關(guān)系，線性范圍150～1.5×106CFU/mL，經(jīng)過富集后檢出限可達(dá)100CFU/mL。該方法靈敏度高，檢出限低，耗時較

3、短，操作簡單，為致病菌的高靈敏檢測提供了新思路。
　　本文將標(biāo)記了萘酰亞胺的ssDNA（單鏈DNA）作為捕獲探針吸附在磁性氧化石墨烯表面，當(dāng)目標(biāo)ssDNA存在時，捕獲探針與目標(biāo)ssDNA部分雜交，利用磁場將目標(biāo)ssDNA捕獲并進行富集，去除原溶液，然后加入釋放探針溶液完成雜交，形成完整雙鏈，使標(biāo)記了熒光的捕獲探針從磁性氧化石墨烯的表面釋放出來，通過測定溶液熒光強度可以實現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7的高靈敏檢測。本文對合成的目標(biāo)DNAT

4、和培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7均進行了檢測試驗，前者用來初步探索實驗的可行性并優(yōu)化實驗條件，后者作為本實驗體系的應(yīng)用，對大腸桿菌的檢測進行進一步的探索。
　　論文研究內(nèi)容和取得的研究成果主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
　　(1)本實驗合成了水溶性良好、熒光強度穩(wěn)定的N-羥乙基-4-N（氨乙基）-1，8-萘酰亞胺（4-N-aminoethyl-N-hydroxyethyl-1，8-naphthalimide，AHA），并將其作為磁性

5、富集熒光法檢測大腸桿菌的熒光劑，為本實驗測量出良好的熒光信號強度提供保障。
　　(2)使用熒光分光光度計定量測量溶液熒光強度，建立檢測大腸桿菌的新體系。以合成目標(biāo)DNA為待測物，對各項實驗條件進行優(yōu)化，具體包括雜交溫度、雜交時間、吸附時間、MGN濃度、釋放探針R濃度和富集倍數(shù)。在最優(yōu)條件下，通過檢測不同濃度待測物存在時的熒光強度，研究待測物濃度和熒光強度之間的線性關(guān)系。
　　(3)培養(yǎng)大腸桿菌O157∶H7細(xì)菌溶液，通過平板