miRNA-21在伊馬替尼敏感型胃腸間質(zhì)瘤中的表達(dá)及通過(guò)B淋巴細(xì)胞瘤-2基位點(diǎn)作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本文預(yù)通過(guò)研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的表達(dá)情況，探索miRNA-21的表達(dá)與伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性，為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤治療新的藥物靶點(diǎn)提供有效的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，我們又進(jìn)一步研究的miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的相互關(guān)系及作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤中的作用基因靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，其研究成果可以直接應(yīng)用到胃腸道間質(zhì)細(xì)

2、胞瘤藥物開(kāi)發(fā)和臨床治療，無(wú)論是對(duì)于提高胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的治療效果，降低其患者醫(yī)療花費(fèi)和社會(huì)家庭的負(fù)擔(dān)均具有重大意義。為其相關(guān)miRNA-21與Bcl-2靶點(diǎn)的抗癌藥物的開(kāi)發(fā)在臨床應(yīng)用的進(jìn)一步推廣提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.胃腸道間質(zhì)瘤組織樣本獲取，胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞培養(yǎng)
　　于Cosmo Bio Co.Ltd(Tokyo，Japan)公司購(gòu)買(mǎi)胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞，細(xì)胞用DMEM配方其主要組成為細(xì)胞溶液中添加1

3、0％的胎牛血清，1％ v/v的青霉素和1％ v/v的鏈霉素(Ameresco，F(xiàn)ramingham，MA，USA)，將細(xì)胞種植在培養(yǎng)瓶中，在5％ CO2、37℃的加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將濃度為85％的胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞在加有2％小牛血清和5uM的伊馬替尼(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞作為伊馬替尼藥物干擾細(xì)胞組。我們利用Lipofectamine RNAiMax(Inv

4、itrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒轉(zhuǎn)染生成含有非特異靶標(biāo)miRNA和含有miRNA-21的85％胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞，并在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)。
　　2.RNA的提取與定量測(cè)量
　　利用TRIzol試劑盒(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)從胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞，正常胃組織作為照組組標(biāo)本中提取總mRNA，并滴加核糖核酸酶抑制劑SUPERase·InTM(Thermo S

5、cientific，Rockford，IL，USA)1μl，通過(guò)RT-qPCR對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，42℃，5 min，接著95℃，10秒鐘逆轉(zhuǎn)錄，95℃，5秒，60℃，20秒，共40個(gè)循環(huán)。用Takara One Step RT-PCT kit(Takara，Tokyo，Japan)試劑盒定量分析Bcl-2 mRNA和miRNA-21的含量。
　　3.熒光素酶印跡實(shí)驗(yàn)
　　我們用熒光素酶把載體插入三個(gè)相同的miRNA-21的

6、靶位點(diǎn)Bcl-2基因3'UTR位點(diǎn)，利用脂質(zhì)體2000將Bcl-2位點(diǎn)和Bcl-2mut位點(diǎn)轉(zhuǎn)染到濃度為85％胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞，同時(shí)將30和60 nM miRNA-21和對(duì)照小RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)24小時(shí)后利用雙熒光素試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
　　4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、MTT比色法和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
　　胃腸道間質(zhì)瘤T1細(xì)胞種植在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔有300個(gè)細(xì)胞，12小時(shí)后培養(yǎng)

7、板分為兩組，第一組加入0μM伊馬替尼，第二組加入5μM伊馬替尼，并且將60 nM非特異靶標(biāo)miRNA和miRNA-21對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)于37攝氏度5％CO2箱中96個(gè)小時(shí)，(0.005％)結(jié)晶紫染色胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞30分鐘，記錄克隆數(shù)量。
　　用MTT比色法主要檢測(cè)處理后的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞活力，其過(guò)程簡(jiǎn)單描述如下，將胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板上，12小時(shí)后培養(yǎng)板分為兩組，第一組加入0μM伊馬替尼，第二組加入

8、5μM伊馬替尼，并且將60 nM非特異靶標(biāo)miRNA和miRNA-21對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞培養(yǎng)于37攝氏度5％CO2箱中48個(gè)小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成MTT溶液在37攝氏度培養(yǎng)2小時(shí)，在分光光度計(jì)上在450nm的光波下測(cè)量其光密度。
　　細(xì)胞活性主要測(cè)量胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞活性相對(duì)比值，用AnnexinⅤ-FITC Apoptosis Detection Kit(Abcam，Cambridge，UK)試劑盒對(duì)胃腸道間質(zhì)

9、瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞在伊馬替尼處理miRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　1.胃腸道間質(zhì)瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的含量及兩者的相關(guān)性分析
　　我們分析比較了全部31例胃腸道間質(zhì)瘤病例特征（表1示），在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)，定量測(cè)量了miRNA-21和Bcl-2表達(dá)，其中miRNA-21/U6相對(duì)量為0.6729±0.07632，其含量顯著低于正常胃組織細(xì)胞的含量(1

10、.0000±0.1085)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0129)，而B(niǎo)cl-2 mRNA水平在胃腸道間質(zhì)瘤組中（1.500±0.1484）顯著性高于正常胃組織細(xì)胞的含量（1.0000±0.1085）(p=0.0103)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接著比較了miRNA-21和Bcl-2 mRNA之間的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系，(R2=0.2450，p=0.0046)，總之，在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞中，m

11、iRNA-21水平下調(diào)，Bcl-2上調(diào)，兩者呈顯著性負(fù)相關(guān)。
　　2.在胃腸道間質(zhì)瘤中miRNA-21的作用位點(diǎn)Bcl-2的3'端非編碼區(qū)與Bcl-2上調(diào)的機(jī)制的關(guān)系
　　通過(guò)對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics，然后測(cè)量Bcl-2的表達(dá)。表2顯示，與轉(zhuǎn)染miRNA相比，轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞miRNA-21水平顯著上調(diào)，而與miRNA-21相反，Bcl-2 mRN

12、A的水平在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào)，(p＜0.05 or p＜0.01 for the30 or60 nM，).
　　為了證實(shí)否是由于miRNA-21作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)，而使Bcl-2的下調(diào)，我們?cè)谵D(zhuǎn)染miRNA-21 mimics和轉(zhuǎn)染對(duì)照miRNA的胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行比較，采用了熒光素酶活性檢測(cè)來(lái)研究Bcl-2的3'非編碼區(qū)質(zhì)粒報(bào)告和單純Bcl-2的3'非編碼區(qū)報(bào)告，熒

13、光素酶報(bào)告顯示，與對(duì)照組轉(zhuǎn)染RNA的胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染30和60 nMmiRNA-21 mimics的胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(p＜0.001 for30 or60nM)，而B(niǎo)cl-2mut報(bào)告miRNA-21 mimics并無(wú)降低熒光素酶，以上研究證實(shí)了在胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞中，miRNA-21作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)，而使Bcl-2的下調(diào)。
　　3.miRNA-21可以使胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼敏感
　

14、　采用克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA-21是否能使細(xì)胞對(duì)伊馬替尼治療敏感，5μM伊馬替尼顯著降低胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆(p＜0.01)，同樣，與對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR的胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞比較，5μM伊馬替尼顯著降低轉(zhuǎn)染60 nM miR-21 mimics胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆(p＜0.001，p＜0.05).，
　　同時(shí)，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染60 nM miR-21 mimics和miR Control對(duì)照的并用伊馬替尼處理的胃腸

15、道間質(zhì)瘤細(xì)胞的活性和細(xì)胞凋亡率，miRNA-21可使胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼藥物的敏感性增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1、我們成功的培養(yǎng)了胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞T1的模型，為進(jìn)一步研究胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的特性奠定了基礎(chǔ)。
　　2、miRNA-21在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較正常胃粘膜細(xì)胞降低，而B(niǎo)cl-2mRNA和Bcl-2蛋白在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)比正常胃粘膜細(xì)胞增高，miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系。

16、>　　3、轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞miRNA-21水平顯著上調(diào)，而B(niǎo)cl-2 mRNA的水平在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào)，在蛋白水平也證實(shí)了Bcl-2蛋白在轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質(zhì)瘤-T1細(xì)胞顯著性下調(diào)。
　　4、在胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞中，miRNA-21作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)，而使Bcl-2的下調(diào)。
　　5、伊馬替尼顯

17、著降低胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆。
　　6、伊馬替尼顯著降低轉(zhuǎn)染miR-21 mimics胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞克隆。
　　7、轉(zhuǎn)染miR-21 mimics和miR Control對(duì)照的并用胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性無(wú)差異，而轉(zhuǎn)染miR-21 mimics和miR Control對(duì)照的并用伊馬替尼處理可以使胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞活性顯著性降低。
　　因此本文通過(guò)研究miRNA-21在胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的表達(dá)情況，探索miRNA-2

18、1的表達(dá)與伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性，為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤治療新的藥物靶點(diǎn)提供有效的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質(zhì)瘤中的表現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)，miRNA-21通過(guò)作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)使其下調(diào)，并且miRNA-21可提高胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的敏感性。本研究其研究成果可以直接應(yīng)用到胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤藥物開(kāi)發(fā)和臨床治療，無(wú)論是對(duì)于提高胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的治療效