牛蒡子苷對高糖下HUVECs血管生成作用的初步探討.pdf

1、目的：
　　1.從牛蒡子藥材中提取牛蒡子苷，優(yōu)化提取分離及純化工藝，將所得牛蒡子苷純品作為本課題研究試藥應(yīng)用到后續(xù)研究中，同時為牛蒡子苷的工業(yè)生產(chǎn)工藝提供實驗依據(jù)。
　　2.研究牛蒡子苷（AT）對高糖作用下的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖、遷移和血管生成是否有抑制作用，并從其對血管內(nèi)皮生長因子（ VEGF-A）、低氧誘導(dǎo)因子（ HIF-1α）、PI3K/Akt及MAPK/ERK信號通路的影響入手，探討其作用機(jī)制，尋

2、找作用靶點(diǎn)，為糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）的防治提供新的途徑。
　　方法
　　1.以AT含量為指標(biāo)，通過正交試驗，優(yōu)化AT的醇提工藝；經(jīng)過大孔吸附樹脂柱粗分，篩選出效果最好的吸附分離方法；最后采用硅膠H柱層析，純化AT，得到AT純品。
　　2.體外培養(yǎng)HUVECs，應(yīng)用高糖（25.0 mmol/L）誘導(dǎo)建立細(xì)胞模型。MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測不同葡萄糖濃度對 HUVECs的影響， DAPI染色等方法觀察 AT對高糖誘導(dǎo)的 H

3、UVECs凋亡情況的影響；MTT法檢測AT對細(xì)胞增殖作用的影響，劃痕實驗檢測AT對細(xì)胞遷移能力的影響，體外小管形成實驗檢測 AT對細(xì)胞血管生成的影響，western blotting法檢測AT對HIF-1α、VEGF-A、PI3K、Akt、 Ras、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)果
　　1.通過正交試驗設(shè)計，確定了 AT的最佳醇提工藝為：脫脂后的牛蒡子干燥粉末，經(jīng)8倍量90％乙醇，回流提取3次，每

4、次2 h，得AT醇提浸膏。醇提浸膏用20%乙醇溶解加水稀釋后靜置得上樣液，過AB-8型大孔吸附樹脂柱，收集50%乙醇洗脫液，得AT粗分物。AT粗分物經(jīng)硅膠H層析柱，氯仿：甲醇（9:1）洗脫，TLC跟蹤，收集單點(diǎn)流份，重結(jié)晶得AT純品，純度達(dá)98%以上。
　　2. MTT法檢測結(jié)果顯示高糖能促進(jìn)細(xì)胞增殖；DAPI染色法、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示高糖不會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，AT對細(xì)胞凋亡也沒有影響。MTT檢測結(jié)果顯示，經(jīng)高糖刺激3、5、7 d

5、后，與LG組比較， HG組細(xì)胞增殖能力明顯增加（P<0.01）；與HG組比較，HG+AT組的細(xì)胞增殖能力明顯降低（P<0.05或P<0.01）。劃痕實驗結(jié)果顯示， HUVECs在高糖刺激下，與LG組比較，HG組細(xì)胞遷移能力明顯增大（P<0.01）；與HG組比較，HG+AT組的細(xì)胞遷移能力明顯下降（P<0.01）。小管形成實驗顯示，4 h時，HUVECs在高糖刺激下，與 LG組比較，HG組細(xì)胞血管腔形成能力增強(qiáng)（P<0.01）；與HG組比

6、較， HG+AT組的細(xì)胞血管腔形成能力明顯下降（P<0.01）。western blotting法檢測結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的HUVECs中HIF-1α、VEGF-A、PI3K、Akt、Ras蛋白表達(dá)量及 p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達(dá)量比值均增加（P<0.05或P<0.01），經(jīng)藥物處理后蛋白表達(dá)量均下降（P<0.05或P<0.01）。
　　結(jié)論
　　1.本課題確定的 AT提取純化方法方便、穩(wěn)定，為工業(yè)大生產(chǎn)提供可靠的