miR-22下調Galectin-9參與肝癌免疫逃逸的作用研究.pdf

1、目的：通過表達水平檢測和生物信息學軟件將Galectin-9與microRNA建立聯(lián)系，驗證miR-22對Galectin-9的靶向調控作用，并研究miR-22-Galectin-9途徑對腫瘤細胞和淋巴細胞增殖凋亡情況以及細胞因子水平的影響。
　　方法：生物信息學分析軟件預測Galectin-9其潛在相關microRNA，qRT-PCR和Western blot方法檢測表達水平。轉染microRNA mimics和Galectin

2、-9-3’UTR熒光素酶報告基因質粒對miR-22與Galectin-9的靶向調控關系進行驗證。HepG2細胞與PBMC共培養(yǎng)，WST-1方法檢測各組HepG2細胞的增殖情況，Annexin-V-Fluos試劑盒流式細胞術檢測淋巴細胞的凋亡情況，qRT-PCR檢測細胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表達水平。
　　結果：生物信息學軟件預測miR-22可能對Galectin-9存在靶向調控作用，且肝癌細胞中Galectin-9表達

3、升高，miR-22表達顯著降低。miR-22通過直接與Galectin-93’UTR結合，在轉錄后水平下調Galectin-9的表達。miR-22-Galectin-9途徑影響共培養(yǎng)體系中腫瘤細胞增殖和淋巴細胞凋亡以及細胞因子的產(chǎn)生，可能參與肝癌細胞的免疫逃逸過程。
　　結論：miR-22下調Galectin-9參與肝癌的免疫逃逸過程。
　　第一部分 Galectin-9及其潛在相關microRNA在肝癌中的表達
　　

4、目的：檢測Galectin-9在肝癌細胞與正常肝細胞中的表達水平，生物信息學軟件預測可能與其存在靶向調控關系的microRNA，并檢測它們在肝癌中的表達情況，確定重點研究靶向關系的一種microRNA。
　　方法：培養(yǎng)人正常肝細胞Lo2和肝癌細胞HepG2、SMMC7721，收集一定數(shù)量的細胞，提取RNA和蛋白質，qRT-PCR和Western blot方法分別檢測Galectin-9在mRNA和蛋白水平的表達情況。使用生物信息學

5、分析軟件miRanda（http://www.microrna.org）和TargetScan（http://www.targetscan.org/）預測可能與Galectin-9存在靶向調控關系的microRNA，選擇miR-22、296-3p、455-5p和491-5p，qRT-PCR法分別檢測它們在正常肝細胞和肝癌細胞中的表達水平。武漢協(xié)和醫(yī)院肝膽外科查閱病人臨床病例和病理參數(shù)，收集肝癌患者肝癌組織和對應癌旁組織標本，提取RNA，

6、檢測miR-22在肝癌組織中的表達水平。
　　結果：Galectin-9 mRNA和蛋白在肝癌細胞中的表達水平高于正常肝細胞，尤其是在HepG2細胞表達最高。生物信息學軟件預測miR-22、296-3p、455-5p和491-5p可能與Galectin-9存在靶向調控關系，其中miR-22和miR-491-5p在肝癌細胞比正常肝細胞中表達低，miR-22表達差異最顯著。同時，miR-22在肝癌組織的表達水平也是明顯低于相應的癌旁組

7、織。
　　結論：生物信息學軟件預測miR-22可能對Galectin-9存在靶向調控作用，且肝癌細胞中Galectin-9表達升高，miR-22表達顯著降低，為進一步驗證兩者之間的靶向關系奠定基礎。
　　第二部分 Galectin-93’UTR熒光素酶報告基因質粒的構建和miR-22對Galectin-9直接靶向調控關系的驗證
　　目的：構建Galectin-93’UTR熒光素酶報告基因質粒，驗證miR-22對Gale

8、ctin-9的靶向調控作用。
　　方法：將miR-22 mimics和Control mimics分別轉入肝癌細胞HepG2中，24小時后，熒光顯微鏡下觀察microRNA mimics的轉染效率并qRT-PCR檢測miR-22的表達差異，同時檢測Galectin-9的mRNA和蛋白表達水平，與未轉染組細胞中的表達水平進行對比，分析Galectin-9表達的變化。基因工程方法構建pCMV-Galectin-93’UTR野生型和變異

9、型熒光素酶報告基因質粒，分別與miR-22 mimics和Control mimics共轉入HepG2細胞，24小時后，使用雙熒光檢測試劑盒檢測各組細胞的熒光強度。
　　結果： microRNA mimics轉染效率約60％，轉染miR-22 mimics的HepG2細胞與轉染Control mimics和未處理組相比，miR-22表達上調，Galectin-9 mRNA表達水平無明顯差異，蛋白表達明顯降低。Galectin-93

10、’UTR熒光素酶報告基因質粒構建成功，熒光素酶報告基因檢測結果顯示，共轉miR-22 mimics和pCMV-Galectin-93’UTR野生型質粒的細胞中，熒光強度明顯較其他三組低。
　　結論：miR-22與Galectin-9存在靶向調控關系，miR-22通過直接與Galectin-93’UTR結合，在轉錄后水平下調Galectin-9的表達。
　　第三部分 miR-22-Galectin-9途徑在肝癌免疫逃逸中的作用

11、
　　目的：研究miR-22-Galectin-9途徑對腫瘤細胞和淋巴細胞增殖凋亡情況以及細胞因子水平的影響，探究該途徑參與肝癌細胞免疫逃逸的分子機制。
　　方法：HepG2細胞分為未轉染組（陰性對照組）、轉染Galectin-9過表達載體組、轉染miR-22 mimics組和Galectin-9過表達載體-miR-22 mimics共轉組，健康供者抽取靜脈血，F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液作密度梯度離心提取外周血單個核細胞（P

12、BMC），然后將上述各組HepG2細胞分別與PBMC共培養(yǎng)，48小時后WST-1方法檢測各組HepG2細胞的增殖情況，Annexin-V-Fluos試劑盒流式細胞術檢測淋巴細胞的凋亡情況，qRT-PCR檢測細胞因子IL-2和IFN-γmRNA的表達水平。
　　結果：轉染Galectin-9過表達載體組，HepG2細胞增殖數(shù)目、PBMC凋亡率高于陰性對照組，IL-2、IFN-γmRNA的表達水平低于陰性對照組。轉染miR-22 mi

13、mics組，HepG2細胞增殖數(shù)目低于陰性對照組，PBMC凋亡率與陰性對照組未發(fā)現(xiàn)明顯差異,細胞因子IL-2的表達水平與正常對照組無明顯差異，而IFN-γ的表達水平高于正常對照組。共轉Galectin-9過表達載體和miR-22 mimics組，HepG2細胞增殖數(shù)目及IL-2、IFN-γmRNA的表達水平與陰性對照組無顯著性差異，PBMC凋亡率低于轉染Galectin-9過表達載體組, IL-2的表達水平高于轉染Galectin-9過