siRNA特異性及脫靶效應(yīng)的研究.pdf

1、RNA干擾(RNA interfering,RNAi)是指進化保守的小干擾RNA(smallinterfering RNA,siRNA)介導(dǎo)的抑制靶基因表達的現(xiàn)象。主要通過降解靶標mRNA從而抑制目標蛋白合成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,有效抑制基因表達。參與這一過程的作用因子是siRNA(約21-23nt),作為關(guān)鍵的媒介與RISC蛋白在細胞質(zhì)中結(jié)合,進而特異性的降解靶標mRNA。由于siRNA的這種特性可以抑制致病基因的突變位點,因此siRNA被廣

2、泛希望于作為新一代的生物臨床治療藥物。
　　 RNA干擾過程中,siRNA和mRNA特異結(jié)合能夠使得靶基因沉默。但研究證實,siRNA還可以與非靶基因結(jié)合而導(dǎo)致非靶基因沉默,這種現(xiàn)象稱為siRNA的脫靶效應(yīng)。
　　 siQuant系統(tǒng)以雙熒光報告檢測技術(shù)為基礎(chǔ),是一種檢測siRNA抑制活性的高通量檢測工具。在siQuant中引入siRNA的靶位點,siRNA的沉默效率可以通過熒光報告基團的活性直接反映出來。
　　

3、 siRNA的沉默特異性和脫靶效應(yīng)是其作為臨床應(yīng)用,特別是在選擇性沉默SNP突變基因過程中遇到的關(guān)鍵問題。然而,目前尚沒有設(shè)計等位基因特異性siRNA的可行性指導(dǎo)原則。本論文以基于siQuant的雙熒光報告系統(tǒng)為主要檢測手段,使用20條siRNAs和相應(yīng)的240條錯配靶序列,以siRNA的4、12和17三個位點為例,發(fā)現(xiàn)siRNA的錯配容忍模式是由其錯配位點決定的,在不同位置具有不同的錯配容忍模式,并且不受周圍序列的影響。本論文進一步使

4、用20條siRNAs和相應(yīng)的260條錯配靶序列對siRNA的錯配模式進行了全面研究,建立了siRNA各堿基在各位點的錯配容忍模式圖譜。
　　 根據(jù)上述得到的siRNA各堿基各位點錯配容忍規(guī)律,將錯配位點放置在siRNA高敏感區(qū)域,從而實現(xiàn)將完全匹配與單堿基錯配選擇性地沉默,即通過人為設(shè)計等位基因特異性siRNA來有效抑制突變治病的等位基因而對正常基因的影響達到最小。本論文設(shè)計抑制PIK3CA基因的兩個致病突變位點的特異性siRN