SIRT5基因沉默對結腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響.pdf

1、結腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一。每年約有120萬新發(fā)病例，60萬人死于結腸癌，在女性腫瘤發(fā)病率中高居第二，男性腫瘤發(fā)病率也排名第三位，近十年我國結腸癌發(fā)病率不斷增加。由于起病隱匿，結腸癌具有發(fā)現晚，放療、化療、手術切除效果差，預后不良等特點。造成這種結果的主要原因為結腸癌細胞的高度侵襲能力和轉移能力。目前，其侵襲轉移的分子機制尚不完全明確。因此，有必要對結腸癌進行深入探索，闡明結腸癌轉移侵襲的具體分子機制，為臨床中結腸癌的早期診斷、轉移預

2、測和有效治療提供新的策略。
　　蛋白質乙?；腿ヒ阴；膭討B(tài)平衡參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種重要途徑，蛋白質去乙酰化的實現有賴于去乙?；傅拇呋?。沉默信息調節(jié)因子2是首先發(fā)現于酵母菌種的一種高度保守的組蛋白去乙?；?，哺乳動物中的沉默信息調節(jié)因子2稱為Sirtuins，包括SIRT1-7。研究表明，Sirtuins通過去乙?；M蛋白和眾多的非組蛋白，參與調控細胞壽命、能量代謝、炎癥反應以及增殖、凋亡等。SIRT5是目前研究最少的Sirt

3、uins家族成員。由于和其他Sirtuins的同源性，SIRT5首先被認為是一個去乙?；?。后來發(fā)現，其去乙?；富钚暂^低，反而具有去琥珀?；?、去丙二酰化、去戊二酰化酶活性。線粒體是存在于身體幾乎所有細胞中的一種細胞器，主要負責能量生成和調節(jié)內環(huán)境穩(wěn)定。作為位于線粒體內的Sirtuins家族最特殊的成員之一，SIRT5通過其多種酶活性作用于包括CPS1、細胞色素C、丙二酰輔酶A、SOD1在內的多種底物，參與線粒體內的多種代謝和細胞凋亡，

4、起到調節(jié)線粒體代謝、細胞周期調控等多種作用。
　　與一系列關于SIRT5在代謝中作用的研究相比，關于SIRT5與腫瘤關系的研究報道極少。最近一篇關于人類高分化漿液性卵巢癌的研究表明，在30％的病例中發(fā)現了SIRT5的高表達。另一研究指出，在進展期非小細胞肺癌中，發(fā)現了SIRT5的高表達，并指出通過對NRF2及其下游靶目標的作用，SIRT5有促進肺癌細胞生長、增殖、增加耐藥性的作用。目前 SIRT5在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制的研

5、究尚無報道。本研究旨在明確SIRT5在結腸癌中的表達情況，探討SIRT5對結腸癌生物學表型的影響及可能的分子機制，為闡明SIRT5在結腸癌診斷、治療中的作用提供潛在的理論基礎。
　　本研究首先采用RT-PCR技術、Western blotting和免疫組化染色技術等檢測結腸腺癌及配對癌旁結腸黏膜組織中SIRT5 mRNA和蛋白表達水平，并分析SIRT5表達與結腸癌臨床病理學參數之間的相關性；然后利用RNA干擾技術，靶向沉默SIRT

6、5基因的表達，Western blotting檢測SIRT5基因沉默效果，篩選出后續(xù)試驗應用的結腸癌細胞LoVo和HCT-15；克隆形成實驗檢測SIRT5沉默后對結腸癌細胞增殖、流式細胞術檢測SIRT5沉默后對結腸癌細胞凋亡的影響，分析SIRT5表達變化對結腸癌LoVo和HCT-15細胞增殖、凋亡的影響；接著應用細胞遷移及侵襲實驗檢測SIRT5沉默對結腸癌LoVo和HCT-15細胞遷移和侵襲能力的影響，同時研究SIRT5沉默對結腸癌Lo

7、Vo和HCT-15細胞上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)指標蛋白（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin)的表達以及基質金屬蛋白酶（MMP2、MMP9）表達水平的影響。為明確SIRT5沉默對結腸癌細胞侵襲轉移能力的影響是否與PTEN/AKT信號傳導通路有關，我們對比了SIRT5沉默組與對照組PTEN/AKT信號通路的改變，進一步分析了試驗結論所發(fā)生的分子機制，

8、探討其潛在的臨床價值。
　　總之，本實驗以 SIRT5為靶點，探討其對結腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響，及其可能的分子機制，共分為4個部分。
　　第一部分：SIRT5在結腸癌中的表達及其預后分析
　　方法
　　1.收集結腸癌及癌旁組織的臨床標本和相關臨床病理資料，采用RT-PCR和Westen blotting實驗方法檢測并分析結腸癌組織、癌旁正常組織中SIRT5 mRNA和SIRT5蛋白的表達水平，采用χ2檢驗比

9、較在結腸癌及癌旁組織中SIRT5mRNA和SIRT5蛋白的表達水平的差異。
　　2.利用多組單因素回歸分析，分析SIRT5的表達與結腸癌瘤體大小、分化程度、TNM分期及遠端轉移情況等臨床病理特征之間有無相關性。
　　結果
　　1.結腸癌組織中SIRT5 mRNA、SIRT5蛋白表達水平明顯高于相應的癌旁組織。
　　2.免疫組化結果顯示，SIRT5在結腸癌組織中的表達水平高于相應的癌旁組織，差異具有統計學意義。同時

10、，SIRT5表達水平與結腸癌患者某些病理學特征存在相關性，具體如下：SIRT5的染色評分與瘤體大?。≒=0.026）、分化程度（P=0.041）、TNM分期（P=0.005）及遠端轉移（P=0.018）情況密切相關，瘤體越大、分化程度約差、TNM分期越高、有遠處轉移的患者，癌組織中SIRT5的染色程度越明顯，但SIRT5的染色程度與患者年齡（P=0.552）、性別（P=0.636）及淋巴轉移（P=0.701）情況無關。
　　第二部

11、分：SIRT5沉默對結腸癌細胞增殖、凋亡的影響
　　方法
　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，檢測結腸癌細胞HCT-15、HT-29、SW480、LoVo中SIRT5的表達水平，篩選出沉默效果較好的LoVo細胞和HCT-15細胞用于后續(xù)試驗。
　　2.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，通過CCK-8細胞增殖檢測、克隆形成實驗，觀察SIRT5表達變化對結腸癌細胞HCT-15和LoVo增殖、克隆形成能力的

12、影響。
　　3.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，流式細胞儀檢測SIRT5沉默的結腸癌細胞 HCT-15和LoVo的凋亡細胞比例，觀察 SIRT5表達變化對結腸癌細胞HCT-15和LoVo凋亡能力的影響。
　　結果
　　1. siRNA轉染可成功下調SIRT5基因在結腸癌細胞中的表達水平（P<0.05）。與其他結腸癌細胞系相比，SIRT5在人結腸癌高轉移細胞系LoVo中，mRNA和蛋白表達水平都呈高表達，差異存在

13、統計學意義（P<0.01）。
　　2. SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15的細胞增殖能力下降，克隆形成數目減少（P<0.05）。
　　3. SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15的凋亡比例增加（P<0.05）。
　　第三部分：SIRT5沉默對結腸癌細胞侵襲轉移能力的影響
　　方法
　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，通過Wound healing試驗（劃痕試驗

14、），檢測SIRT5基因沉默對結腸癌細胞LoVo和HCT-15遷移能力的影響。
　　2.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，通過Transwell侵襲試驗，檢測SIRT5基因沉默對結腸癌細胞LoVo和HCT-15侵襲能力的影響。
　　3.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，通過Western Blotting法檢測SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15上皮屬性蛋白E-cadherin以及間質屬性蛋白N-

15、cadherin、Vimentin以及金屬基質蛋白MMP2、MMP9的表達水平，評價SIRT5在結腸癌細胞上皮間質轉化中的作用。
　　4.所有數據均采用SPSS12.0進行統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗；計量資料采用t檢驗，P<0.05有統計學意義。
　　結果
　　1. SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15的遷移能力降低（P<0.05）。
　　2.SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和H

16、CT-15的侵襲能力降低（P<0.05）。
　　3.SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15中上皮屬性蛋白E-cadherin表達升高，間質屬性蛋白N-cadherin、Vimentin的表達下降，金屬基質蛋白MMP2及MMP9表達降低（P<0.05）。
　　第四部分：SIRT5沉默對結腸癌細胞增殖、凋亡、轉移影響的機制研究
　　方法
　　1.利用siRNA靶向沉默SIRT5的表達，觀察SIRT5基

17、因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15中PTEN表達和AKT磷酸化水平的變化。
　　2.通過聯合干擾SIRT5、PTEN的表達，檢測LoVo和HCT-15細胞中AKT磷酸化水平的改變，明確SIRT5是否通過PTEN/AKT通路影響結腸癌細胞的侵襲轉移能力。
　　結果
　　1. SIRT5基因沉默后，結腸癌細胞LoVo和HCT-15中PTEN表達均上調，同時AKT的磷酸化的水平受到抑制（P<0.05）。
　　2

18、.聯合干擾 SIRT5、PTEN的表達后，結腸癌細胞 LoVo和HCT-15中，SIRT5-shRNA穩(wěn)轉株中瞬時轉染PTEN-siRNA組較單獨SIRT5-shRNA組AKT磷酸化水平均發(fā)生上調（P<0.05）。
　　結論
　　1.結腸癌組織中SIRT5 mRNA、SIRT5蛋白表達水平明顯高于相應的癌旁組織，且與某些病理學特征有關，SIRT5基因可在結腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲遷移中發(fā)揮重要作用，成為結腸癌轉移和預后評估的分子