缺氧預處理骨髓間充質干細胞鞘內移植對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是胸腹主動脈手術常見的并發(fā)癥。脊髓缺血再灌注預后較差，常導致癱瘓或者死亡，給患者及家屬帶來沉重負擔。因此，尋找有效的預防措施對于改善脊髓缺血再灌注損傷的預后具有重要意義。
　　目前臨床上對于SCIRI的治療措施包括外科手術、藥物治療、基因治療和移植治療等，然而外科手術治療的關鍵時間點難以把握;藥物治療的進展不大，目前并無明顯的特效藥的普遍應用;基因治療尚處于探索階段;而干細胞移

2、植和外周神經移植是后期治療脊髓嚴重損傷的一種比較有希望的方法。近年來，細胞移植技術在多種組織及器官損傷的修復中得到廣泛應用。已有多項研究證實BMSCs移植能夠有效地減輕SCIRI。然而細胞移植后在缺血組織中出現(xiàn)大量凋亡，嚴重影響了治療效果。盡管目前移植細胞死亡的原因仍不十分清楚，但缺血組織的血供不足、低氧、炎性反應、氧化應激以及細胞毒性物質積累都對移植細胞的存活造成不利影響。因此，如何減少BMSCs移植后的凋亡，提高BMSCs在體內的存

3、活率是目前干細胞移植亟待解決的問題。
　　目前，多項體外研究已經證實缺氧預處理能夠提高間充質干細胞對缺氧環(huán)境的適應性，提高細胞活性并且抑制細胞的凋亡。體內研究也指出移植之前在體外進行缺氧預處理能夠有效提高骨髓間充質干細胞的活性以及組織修復能力。研究發(fā)現(xiàn)缺氧預處理能夠顯著提高骨髓間充質干細胞的活性、趨化能力，促進神經營養(yǎng)因子分泌，并能夠提高移植后骨髓間充質干細胞對腎缺血再灌注損傷、心肌缺血再灌注損傷、腦損傷等的保護作用。
　　

4、然而，關于缺氧預處理能否提高BMSCs對SCIRI的保護作用及其機制尚未見報道。故而，本研究通過提取經缺氧預處理的BMSCs，并將其移植到SCIRI的脊髓組織中來探討缺氧預處理后的BMSCs對SCIRI保護作用，以期為BMSCs對SCIRI的保護作用的高效完成提供新的思路?；谝陨涎芯勘尘埃覀兺茰y缺氧預處理能夠提高間充質干細胞在移植后的活性，促進其對缺血再灌注損傷的保護作用。
　　研究方法:
　　1.實驗動物
　　健

5、康成年SD大鼠60只，體重200-250 g，購于中國醫(yī)科大學動物實驗中心。
　　2.實驗方法
　　2.1提取、培養(yǎng)、鑒定、缺氧預處理大鼠BMSCs。
　　2.2實驗分組
　　SD大鼠隨機分為5組，每組12只。
　　Sham組:擬行單純手術操作不進行缺血再灌注;
　　I/R組:只進行缺血再灌注處理;
　　NP-BMSC組:在脊髓缺血再灌注損傷前鞘內注射未預處理的BMSC;
　　HP-BMS

6、C組:在脊髓缺血再灌注損傷前鞘內注射缺氧預處理的BMSC;
　　PBS組:在缺血再灌注鞘內注射等量PBS。
　　2.3建立大鼠缺血再灌注損傷模型
　　3.觀察指標
　　3.1改良Tarlov評分標準神經功能評分
　　3.2熒光標記觀察移植BMSCs在體內的遷移、分布
　　3.3伊文思藍血脊髓屏障完整性檢測
　　3.4HE染色檢測脊髓組織的病理學變化
　　3.5TUNEL檢測脊髓組織的細胞凋

7、亡情況
　　3.6Real-time PCR檢測脊髓組織中HIF-1α mRNA的表達
　　3.7Western blot檢測脊髓組織中HIF-1α蛋白的表達
　　實驗結果:
　　4.1神經功能評分
　　每組大鼠分別于術后6h、12 h、24 h、48 h、7d進行神經功能評分，結果顯示與PBS組相比，HP-MSCs組和NP-MSCs組均能夠提高神經功能評分;且HP-MSCs組的評分顯著高于NP-MSCs組

8、。
　　4.2熒光標記觀察移植BMSCs在體內的遷移、分布
　　BMSCs經CFSE和DAPI雙標記后，胞漿為綠色，胞核為藍色，界限清晰。48h和7d后，HP-MSCs組移植存活的BMSCs細胞數目均明顯多于NP-MSCs組。
　　4.3伊文氏藍染色來檢測每組大鼠血脊髓屏障的完整
　　I/R組大鼠BSCB嚴重損害，HP-MSCs組和NP-MSCs組伊文氏藍滲透則明顯減弱，且HP-MSCs組脊髓損傷組織伊文氏藍濃度

9、顯著低于NP-MSCs組BMSCs。
　　4.4HE染色檢測大鼠損傷脊髓的病理變化
　　I/R組和PBS組的脊髓損傷比較嚴重，NP-MSCs組和HP-MSCs組核碎裂少見，損傷明顯較輕，HP-MSCs組的組織形態(tài)更接近于正常脊髓組織。
　　4.5TUNEL染色檢測脊髓組織細胞凋亡
　　與sham組相比，I/R組和PBS組的細胞凋亡數目更多，而NP-MSCs組的凋亡細胞數目顯著減少。同時HP-MSCs組的凋亡細胞數

10、目又顯著低于NP-MSCs組。
　　4.6Real-time PCR檢測脊髓組織中HIF-1α的表達
　　與I/R組相比，NP-MSCs組和HP-MSCs組HIF-1α mRNA表達水平明顯增加，并且HP-MSCs組HIF-α又顯著高于NP組。
　　4.7Western blot檢測脊髓組織中HIF-1α蛋白的表達Western blot的結果證實與I/R組相比，NP-MSCs組HIF-1α蛋白的表達明顯增加，同時HP